| 研究課題/領域番号 |
16K16610
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| 研究機関 | 東洋大学 |
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研究代表者 |
萩尾 真人 東洋大学, 生命科学部, 助教 (00623927)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 腸内環境 / 腸内細菌叢 / T-RFLP |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度は、研究計画に挙げた①「腸内細菌叢簡易評価法確立の継続」を行い、その完成を目指すとともに、実践として②「動物実験への適用」を目指した。前年度の継続検討として、③胆汁酸、短鎖脂肪酸、有機酸の高感度分析法の確立を目指した。
①に関し、前年度の時点でマウスの腸内細菌叢をクラスター分類すること自体は達成したが、他手法との比較および実使用のための設定調整に関しては不十分な点があった。具体的には、T-RFLP実施後の取得データにおける断片DNAの上限塩基長の設定基準や、クラスター分類で使用する解析法および結合法の選択に関する点である。検討の結果、実験条件ごとに最長断片DNAが異なることが予想されるためDNA断片長の設定はその都度行うこととし、分類法の内訳として最終的には「ユークリッド距離」と「ウォード法」の組み合わせによる「階層クラスター分類」を使用することとした。
②に関し、予備検討としての「強制走行運動が腸内細菌叢に与える影響」を実施する際に①を適用した。検討の結果、個体間の腸内細菌叢分類ではテスト飼育開始後3日で運動群の個体同士の菌叢が類似し、その後非運動群の菌叢に近づいた。同一個体の経時的変化を追跡したところ、菌叢変化の変化幅が飼育開始後1日後に最も大きくなる個体が多く見受けられた。上記2種の解析は、DNAシーケンサーによる測定結果を得てから速やかに実行することが可能となった。
③に関し、胆汁酸はイオンモビリティによる測定可能性があるものの、短鎖脂肪酸と有機酸は現在使用しているLC-MS（UPLC/Synapt G2）では測定が困難であり、GC-MSなどの機器に変更する必要があると判断した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２９年度の進捗状況は、「（2）おおむね順調に進展している。」と考えられる。研究計画の①「腸内細菌叢簡易評価法確立の継続」および②「動物実験への適用」を達成できた点が判断の根拠である。しかし、①に関してはさらなる改良をすることで、解析の幅が広がり（多角的解析の提案）かつ解析精度も向上すると予想しているため、さらに改善を施す予定である。また②に関しても今後安定した解析法適用を可能とするためには、例数として十分でないため、さらなる予備検討を重ねる必要がある。③に関しては、所属機関内の最適な機器を慎重に選定する必要がある。
①に関しては、前年度の時点でウォード法を使用することとしていたが、群平均法などの他手法との比較検討を行っていなかった。ウォード法は分類感度が優れている一方で計算量が多いため、通常使用のPCで計算可能か確かめた。結果、1検体当たり1000塩基長分のパラメーターを個体数12の場合で適用しても、計算時間に問題は見受けられなかったため、ウォード法を使用することとした。
②に関して、上記にもあるように今回の検討では12匹のマウスを使用し、1週間の試験飼育を行った。毎日糞を回収し、「個体間菌叢分類」および「同一個体での経時的菌叢変化」に関する解析を可能としたが、これは必要最小限の解析であると考えている。今後、「腸内環境」を比較するためにさらにパラメーターを増やし、動物個体数も増加していく予定であるため、この時点での計算が比較的軽量であることは非常に重要であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度は、おおむね当初計画していた通りに研究を進めることができたが、本年度成果に関しさらなる改善の余地が残っている。
①前年度にも掲げた、制限酵素の複数使用による菌叢情報の詳細化や、複数蛍光プライマー使用による多検体同時分析などを実用化することができれば、さらなる分析精度および分析効率の向上が見込めるため、評価法の改善を目指したい。
②さらなる予備検討を重ね、①の評価法精度と効率の向上に役立てたい。
以上のことを考慮しつつ、H30年度の研究計画を遂行する。可能な限り迅速に「腸内細菌叢簡易評価法」を「腸内環境簡易評価法」にまで発展させ、①運動が腸内環境へ及ぼす影響、ならびに②運動による大腸癌リスク減少効果への腸内環境の関与解明を目指す。
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