| 研究課題/領域番号 |
16K17932
|
|---|
| 研究機関 | 名古屋大学 |
|---|
研究代表者 |
神谷 由紀子 名古屋大学, 工学研究科, 准教授 (00527947)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | siRNA / RNA干渉 / 蛍光イメージング / FRET / 色素対 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、我々がこれまでに開発してきた消光剤-蛍光基導入型siRNA(F-Q型siRNA)に加えて新たにFRET型siRNAを開発し、これらのsiRNAをイメージングプローブとして活用することで、RNAiシステムで生じる様々な状態のsiRNAを検出し、これまで詳細が不明であったsiRNAの細胞内動態を明らかにすることを目指している。
前年度に明らかにしたFRETに最適な色素ペアを導入したsiRNAやpre-miRNA、F-Q型siRNAを調製し、これを用いて実際に細胞内イメージング解析を行うことでsiRNAあるいはmiRNAが活性本体であるRISCを形成する過程の詳細を明らかにすることを試みた。解析にはRNAiの活性本体であるRISCを構成するタンパク質Argonaute2(AGO2)を免疫染色することで、siRNAとAGO2の局在性の比較を行った。HeLa細胞に合成したsiRNAプローブを導入し、イメージング解析を行った結果、内在性のAGO2とsiRNAあるいはmiRNAが共局在する様子を観察することができた。また、RISC形成機構の解析を行うために、AGO2の各種変異体を組み合わせた解析にも取り組んだ。AGO2の変異体を可視化するために、HaLo-Tag融合タンパク質としてAGO2を発現させるプラスミドの構築を行った。このプラスミドを用いて細胞内でAGO2変異体を発現させ、HaLo-tagに対する蛍光リガンドを培地中に添加することでAGO2変異体の可視化を行った。HaLo-tag融合型AGO2変異体を発現させた細胞に各種色素導入siRNAを導入し、AGO2変異体とsiRNAの挙動を蛍光観察した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
イメージングとなるFRET型siRNAや蛍光-消光型のsiRNA、FRET型pre-miRNAを合成し、実際に細胞内でイメージング解析を行うことができた。またRISC形成機構解明のため、AGO2変異体を用いたイメージング解析にも取り組んだ。
|
| 今後の研究の推進方策 |
HaLo-tag融合型AGO2変異体と色素導入型siRNAのイメージング解析を推し進める。またイメージング結果の定量化を試み、siRNAのRISC形成機構を明らかにする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度末に産前産後の休暇及び育児休業を取得した。平成29年度から復帰したが、子の養育ための時間を確保する必要があり、研究時間の確保が難しかった。そのため予定していた研究が完了しておらず事業期間を延長した。引き続き色素対導入型のsiRNAを用いた細胞内イメージング解析を遂行するための物品費等で使用する予定である。
|
