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本研究では、我々がこれまでに開発してきた消光剤-蛍光基導入型siRNA(F-Q型siRNA)に加えて、新たにFRET型siRNAを開発し、これらのsiRNAをイメージングプローブとして活用することで、RNAiシステムで生じる様々な状態のsiRNAを検出することを試みた。本解析により、これまで詳細が不明であったsiRNAの細胞内動態を明らかにすることを通じて、RNAi機構の詳細を理解することを目指した。
これまでにsiRNAに導入するべきFRETの色素ペア・導入位置の最適化に成功し、解析に用いるsiRNA設計の基盤を確立していた。また、これを用いた細胞内イメージング解析を行っており、RNAiの活性本体であるRISCの構成蛋白質であるArgonaute2(AGO2)との免疫染色による解析を進めていた。これにより、開発した色素導入型siRNAを用いた、イメージング解析が実行可能であることを明らかにしていた。最終年度は前年度までに開発した色素対導入型siRNAやpre-miRNAを用い、詳細な細胞内イメージング解析へと展開した。またAGO2を可視化するために、Halo-Tag融合タンパク質としてAGO2を細胞内に発現させ、AGO2の挙動をsiRNAとともに観察した。イメージング解析ではRISCの細胞内局在化が観測されたため、関連するタンパク質との相互作用に着目した解析も実施した。RISC局在化の定量化解析にも取り組み、細胞内のRISC局在化機構の解明を行った。
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