|
代謝を利用した有用物質生産では、目的物質の生産に適した代謝状態を達成するように、フラックス分布を適切に制御することが重要である。本研究課題では、蛍光タンパク質を利用した代謝可視化技術を利用して、培養プロセスの制御方法の開発を目指した。本年度は、メバロン酸生産大腸菌に、解糖系とペントースリン酸経路のフラックス比制御システムを導入した株を用い、誘導剤であるイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）の濃度を変更して、各条件におけるメバロン酸の生産性を測定した。13C代謝フラックス解析を行いてフラックス分布を明らかにし、メバロン酸の生産に最適なフラックス比を実験的に決定した。メバロン酸収率に細胞増殖が影響することが明らかになったため、増殖抑制時についても本解析を実施して最適フラックス比を決定した。また、メバロン酸合成遺伝子、解糖系フラックスセンサー、フラックス比制御システムをすべて導入した菌株を構築した。
次に、フラックスを可視化する反応の拡大を試みた。転写因子ArcAの活性を蛍光タンパク質で測定するセンサーを構築し、ArcA活性と呼吸鎖のフラックスの間に負の相関があることを見出した。呼吸鎖とTCA回路は補酵素NADHを介して繋がっており、このセンサーを用いることで、TCA回路のフラックスを可視化できることを示した。
IPTGによる遺伝子発現の誘導は一度添加した薬剤を除くことが難しいため、光刺激による遺伝子発現の誘導システムを導入した。シアノバクテリア由来の光感知システムを利用して、中枢代謝経路の分岐点にスイッチを構築し、緑色もしくは赤色光の照射により代謝を制御できることを確認した。今後は、蛍光タンパク質によりフラックスを検知し、光照射によりフラックスを制御するというプロセスに発展できると期待できる。
|
