| 研究課題/領域番号 |
16K18299
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡野 憲司 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), その他 (40623335)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | リグノセルロース / 芳香族化合物 / Lactobacillus plantarum |
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| 研究実績の概要 |
脱石油化・低炭素化社会の実現に向け、バイオマス資源から多様な化学品を生産する技術の開発は重要である。バイオプラスチック生産においては脂肪族ポリマーの生産が中心であったが、より力学的物性・耐熱性の高い芳香族ポリマーの生産技術の開発が期待されている。また原料バイオマスとしては賦存量の多いリグノセルロース系バイオマスの利用技術が重要であるが、その加水分解産物（LCH）の利用においてはキシロースやアラビノースといったペントースの資化能、およびグルコースとの同時資化能が重要となる。そこで本研究ではLCHからの芳香族化合物の大量生産技術の開発を目指した。
前年度までに乳酸菌Lactobacillus plantarumのldhL1およびldhD遺伝子の欠損を行うことで、乳酸を生産しない株の創製を行った。また本株のホスホケトラーゼ経路を遮断し、ペントースリン酸経路の導入を行い、キシロース資化能の賦与を行うことで、グルコースとペントースの同時利用が可能で乳酸を生産しない株の構築に成功した。しかしながら、キシロースの資化速度がグルコースに比べ著しく遅く、本年度はキシロース資化能の強化を試みた。原因は不明であるが構築した株は、遺伝子欠損や置換の頻度が極めて低く、更なる改良は困難を極めた。そこで、ldhL1およびldhD遺伝子の二重欠損株ではなく、ΔldhL1株を出発にホスホケトラーゼ遺伝子（xpk1, xpk2）のノックアウト、トランスケトラーゼの遺伝子の導入、キシロースイソメラーゼとキシルロキナーゼ遺伝子の導入（各2コピーずつ染色体に挿入）を行った結果、グルコースに匹敵する速度でキシロースを消費可能な乳酸菌の育種に成功し、現在は本株のldhD遺伝子の削除を行っているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本年度は乳酸菌Lactobacillus plantarum ΔldhL1株のホスホケトラーゼ経路を遮断し、ペントースリン酸経路を導入し、キシロースイソメラーゼとキシルロキナーゼ遺伝子を2コピーずつ導入することで、グルコースとペントースの同時利用が可能で乳酸を生産しない株の構築に成功した。前年度に作成した、ldhD破壊用のプラスミドを導入し、本株のldhD遺伝子を破壊することで、本研究の目的であるLCHからのフェニル乳酸（芳香族化合物）生成の土台となる株を構築できると考えられる。現時点ではこの土台株の構築に多大な時間を費やしており、本年度の研究計画として挙げていたフェニル乳酸生産のためのシキミ酸経路を構成する酵素や遺伝子の制御系の解明や、シキミ酸生産経路の導入に着手することができず、研究に遅れをきたしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は構築したグルコース・ペントースの同時資化株のldhD遺伝子を破壊した後、フェニル乳酸生産性の強化を行う。フェニル乳酸は解糖系で生じるホスホエノールピルビン酸（PEP）とE4Pを出発物質としてシキミ酸経路を通じて生産される。大腸菌における先行研究ではPEPとE4Pから3-deoxy-D-arabino-heputulosonate 7-phosphate（DAHP）を合成するDAHP合成酵素や、コリスミ酸をプレフェン酸へと異性化するコリスミ酸異性化酵素が、フェニルアラニン（Phe）やチロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）などの芳香族アミノ酸によってフィードバック阻害や転写レベルでの発現抑制を受けることが知られる。そこでL. plantarumにおいてもこのような制御機構が存在するかを確認する。抑制が存在する場合は、両酵素のプロモーターを恒常発現用のプロモーターに置換し、抑制の解除を行う。続いて両酵素を大腸菌で発現・精製し、これらの酵素活性がPhe、Tyr、Trpにより阻害を受けるかを確認する。阻害を受ける場合は、大腸菌やコリネ型細菌由来のフィードバック阻害耐性の変異酵素の遺伝子をL. plantarumに導入し、阻害の解除を行う。またこれと並行してPEPをピルビン酸へと変換するエノラーゼおよび、フェニル乳酸生産経路からPhe、Tyr、Trp合成へ分岐するための酵素群をコードする遺伝子を欠損させた組換え体の作成を行い、フェニル乳酸合成に不要な代謝経路の遮断を試みる。
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