| 研究課題/領域番号 |
16K18374
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| 研究機関 | 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所) |
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研究代表者 |
大島 知子 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所 感覚機能系障害研究部, 流動研究員 (50731783)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 感覚器 / 蝸牛 / 網膜 / シナプス / 神経伝達物質放出 / グルタミン酸イメージング |
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| 研究実績の概要 |
聴覚および視覚の感覚器においては、スパイクではなく緩電位によって情報伝達が行われている。本研究では、終末部にシナプスリボンという共通構造を有する蝸牛の有毛細胞および網膜の双極細胞における神経伝達物質（グルタミン酸）の開口放出の動態をイメージング法（グルタミン酸イメージング）を用いて比較検討し、聴覚情報処理と視覚情報処理の基盤メカニズムを解明する。また、有毛細胞や双極細胞のシナプスリボンをノックアウトした際の効果を解析する。これらの実験により、「蝸牛および網膜において、シナプスリボンはグルタミン酸の開口放出を制御することによって応答の多様性を作り出すのに寄与する」という仮説を検証する。
平成28年度研究計画：① 野生型マウス蝸牛急性標本もしくは単離内有毛細胞を用いてグルタミン酸イメージング系を立ち上げ、グルタミン酸蛍光プローブの最適化を行う。② 野生型マウス内有毛細胞をホールセルクランプした後に脱分極刺激を与えて、グルタミン酸イメージングにより神経伝達物質放出量を計測する。その際に、シナプスリボンの蛍光マーカーであるCtBP2結合ペプチドをホールセル電極経由で細胞内に導入し、シナプスリボンの様態も併せて確認する。③ 同一有毛細胞内の10－20個あるシナプス間での神経伝達物質放出の多様性について解析する。
平成28年度研究成果：① 野生型マウス（生後2週前後）の蝸牛・内有毛細胞を対象として、グルタミン酸蛍光プローブの最適化を進めた。② 野生型マウス（生後2週前後）の蝸牛・内有毛細胞からカルシウム電流およびそれに膜容量変化の測定を行い、先行研究（Beutner & Moser T. J Neurosci. 21:4593-4599, 2001）と同様の結果を得た。③ 野生型マウス網膜・双極細胞を対象として、グルタミン酸蛍光プローブの最適化を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
まず、野生型マウス（生後2週前後）の蝸牛・内有毛細胞を対象としてグルタミン酸蛍光プローブの最適化を進めたが、高濃度カリウムによる脱分極刺激に対して内有毛細胞での明確な蛍光シグナル上昇を確認できなかった。このため、内有毛細胞の活性に問題がある可能性を疑い、シナプス伝達の指標となるカルシウム電流およびそれに膜容量変化の測定を行ったが、先行研究（Beutner & Moser T. J Neurosci. 21:4593-4599, 2001）と同様の結果であった。
代わって、野生型マウス網膜・双極細胞を対象としてグルタミン酸蛍光プローブ導入実験を実施したところ、静止状態（脱分極刺激を行わない状態）で終末部に良好な蛍光シグナルを認めたため、網膜の実験を先行させることにした。しかしながら、脱分極刺激を行っても蛍光シグナルの上昇が生じないため、シナプス伝達の指標となるカルシウム電流を測定すると消失していた。そこで実験用細胞外液の組成を見直したところ、一部の試薬に問題があることが明らかとなり、以後の実験で修正したところカルシウム電流が安定して記録できるようになった。
改めて、野生型マウス網膜・双極細胞を対象としてグルタミン酸イメージング実験を実施したものの、やはり明確な蛍光シグナル上昇を認めなかったため、グルタミン酸蛍光プローブが十分に機能していないという結論に至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究で使用しているグルタミン酸蛍光プローブは細胞膜表面に発現するレクチンを足場として結合する。今後は、網膜・双極細胞や蝸牛・有毛細胞に発現するレクチンのスクリーニングを行い、プローブの再設計を視野に置いて進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
１．所属研究室の予算で超純水製造装置が整備されたため。
２．実験動物を所属施設内の経費にて調達できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験動物購入費、試薬購入費、学会出張費など。
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