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2016 年度 実施状況報告書

超解像によるNMDA受容体サブユニット局在調整機構解析

研究課題

研究課題/領域番号 16K18376
研究機関群馬大学

研究代表者

小金澤 紀子  群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90643114)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
キーワードNMDA型受容体 / ドレブリン / 樹状突起スパイン / 超解像顕微鏡
研究実績の概要

高次脳機能の実現において重要な役割を果たす要素の一つであるNMDA型グルタミン酸受容体は様々なサブユニットを持ち、各サブユニットの局在変化がシナプス機能・可塑性へ影響を及ぼすことが知られている。本研究では樹状突起スパインにおける各サブユニットの局在の経時変化を明らかにすると同時に、神経活動依存的にその局在を変えるドレブリンやシナプス足場タンパク質との相互関係を明らかにすることを目的としている。ドレブリンはNMDA受容体サブユニット輸送を制御する要因の1つである可能性が考えられており、本研究では特に超解像顕微鏡を用いて樹状突起スパインという微小環境における受容体やドレブリンの局在について着目する。さらに、ヒトiPS細胞由来神経細胞についてもNMDA受容体サブユニット等の局在解析を目指し、種差を超えた共通のシナプス機能機構の解明につなげたい。そのためには、ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養方法を確立させていくことも重要である。
これまでに、NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現についてドレブリンノックアウト動物を用いた検証を行ってきた。ドレブリンはE型アイソフォームとA型アイソフォームがあるが、A型アイソフォーム特異的ノックアウト動物(DAKO)と、E型・A型両アイソフォームノックアウト動物(DXKO)を通常個体(WT)と比較することにより、NMDAR各サブユニットとドレブリンE型・A型アイソフォームとの相互関係を概観してきた。各マウス(WT、DAKO、DXKO)から調整した初代培養神経細胞を用いて経時的に各サブユニットの発現数を計測した。また、超解像顕微鏡による局在解析を行うための色素等も検討し、様々なシナプスタンパク質(ドレブリン、シナプシンI、PSD-95)の局在解析が進んでいる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに、①NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現についてドレブリンノックアウト動物を用いた検証、②生化学的手法による各サブユニットの発現量検証、③超解像顕微鏡によるタンパク質局在解析手法の改善、④ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養法の確立、を行ってきた。①については、ドレブリンはE型アイソフォームとA型アイソフォームがあるが、A型アイソフォーム特異的ノックアウト動物(DAKO)と、E型・A型両アイソフォームノックアウト動物(DXKO)を通常個体(WT)と比較することにより、NMDAR各サブユニットとドレブリンE型・A型アイソフォームとの相互関係を概観してきた。具体的には、各マウス(WT、DAKO、DXKO)から調整した初代培養神経細胞を用いて経時的に各サブユニットの発現数を計測した。②は各動物から脳を摘出し、ウェスタンブロッティング法により各サブユニットの発現量を定量した。③については、超解像顕微鏡による局在解析を行うために、まずは細胞の培養条件を検討し、適切なチャンバーを選定した。さらに色素等も検討し、ダイレクトラベリングも行えるようになっている。既にいくつかのシナプスタンパク質、ドレブリンやシナプシンI、PSD-95などの局在解析が進んでいる。④は、いくつかのヒトiPS細胞由来神経細胞を用いて培養を試み、その方法を検討中である。

今後の研究の推進方策

今後は超解像顕微鏡による各サブユニット局在の詳細検討、並びに足場タンパク質の関与について検証を行っていく。また、ヒトiPS細胞由来神経細胞についても同様の解析を検討していく。

次年度使用額が生じた理由

超解像顕微鏡を用いた解析において、条件検討に少し時間を費やす結果となった。加えて、超解像顕微鏡解析ではデータサイズが大きいため、画像取得・ならびに画像解析に時間がかかる。そのため、当初予定していたほど抗体等の消費が進まなかった。

次年度使用額の使用計画

超解像顕微鏡を使用する際の条件がほぼ確定したので、今後は超解像顕微鏡の解析が中心となっていく。そのため抗体や封入剤等の消費が前年度よりは多くなることが見込まれるので、その分に充てていく。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 3件)

  • [雑誌論文] The role of drebrin in dendritic spines2017

    • 著者名/発表者名
      Koganezawa N, Hanamura K, Sekino Y, Shirao T.
    • 雑誌名

      Molecular and Cellular Neuroscience

      巻: ー ページ: 印刷中

    • DOI

      10.1016/j.mcn.2017.01.004.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] The role of drebrin in neurons2017

    • 著者名/発表者名
      Shirao T, Hanamura K, Koganezawa N, Ishizuka Y, Yamazaki H, Sekino Y.
    • 雑誌名

      Journal of Neurochemistry

      巻: ー ページ: ー

    • DOI

      10.1111/jnc.13988.

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Nanoscale organization of synaptic proteins: super-resolution imaging study2017

    • 著者名/発表者名
      Noriko Koganezawa and Tomoaki Shirao
    • 学会等名
      第7回 国際放射線神経生物学会大会
    • 発表場所
      湯沢
    • 年月日
      2017-02-09 – 2017-02-10
    • 国際学会
  • [学会発表] Developmental regulation of NMDA receptor subunits expression by drebrin2016

    • 著者名/発表者名
      Noriko Koganezawa and Tomoaki Shirao
    • 学会等名
      Society for Neuroscience 45th Annual Meeting
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      2016-11-12 – 2016-11-16
    • 国際学会
  • [学会発表] Drebrin regulates expression pattern of NMDA receptor subunits2016

    • 著者名/発表者名
      Noriko Koganezawa and Tomoaki Shirao
    • 学会等名
      第39回日本神経科学大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2016-07-20 – 2016-07-22
  • [学会発表] Nanoscale organization of synaptic proteins revealed by super-resolution imaging2016

    • 著者名/発表者名
      Noriko Koganezawa, Shuchuan Miao, Yuko Sekino, Tomoaki Shirao
    • 学会等名
      The 10th FENS Forum of Neuroscience
    • 発表場所
      Copenhagen, Denmark
    • 年月日
      2016-07-02 – 2016-07-06
    • 国際学会

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公開日: 2018-01-16  

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