階層的ゲノム・エピゲノム編集法を用いた疾患発症モデリング技術の開発

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K18478
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 佐久間 哲史 広島大学, 理学研究科, 特任講師 (90711143)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: がん / ゲノム編集 / エピゲノム編集 / マイクロホモロジー媒介性末端結合 / MMEJ / ゲノム生物工学 / CRISPR-Cas9 / TALEN

研究実績の概要

ゲノム編集については、DNA二本鎖切断（DSB）の修復経路に関わる因子を、ゲノムDNA上の標的領域に集積させることで、MMEJ依存的遺伝子ノックイン（PITCh）をはじめとしたさまざまなゲノム編集を効率化させるlocal accumulation of DSB repair molecules（LoAD）法を確立した。更に、LoAD法を応用し、PITChによる複数遺伝子座への同時ノックインを実現した。これらの成果について、責任著者として論文を取りまとめ、現在国際学術雑誌に投稿中である。
一方エピゲノム編集については、これまでに開発されてきたエフェクター直接融合型やエフェクター集積型の効果を上回る、エフェクター超集積型システム（three-component repurposed technology for enhanced expression; TREE）を新たに開発した。TREEシステムを用いることにより、従来システムでは顕著な発現の活性化がみられなかったがん関連遺伝子の発現を強く誘導できることが明らかとなった。更に、TREEシステムの優位性が細胞種や遺伝子座に依存しないことを証明し、普遍的に高い効果を示すエフェクター集積システムとして利用可能であることが示唆された。本成果についても、責任著者として論文を取りまとめ、現在国際学術雑誌に投稿中である。また、「標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物、およびその利用」として特許出願を完了した（特願2018-041322）。
これらの成果により、ゲノム編集・エピゲノム編集の両面から、多因子性の複雑な疾患の発症をモデリング可能な技術が確立された。

研究成果

• [雑誌論文] PLEKHN1 promotes apoptosis by enhancing Bax-Bak hetro-oligomerization through interaction with Bid in human colon cancer (2018)
  • 著者名/発表者名: Kuriyama S, Tsuji T, Sakuma T, Yamamoto T, Tanaka M.
  • 雑誌名: Cell Death Discov 巻: 4 ページ: 11
  • DOI: 10.1038/s41420-017-0006-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs (2018)
  • 著者名/発表者名: Kim SI, Matsumoto T, Kagawa H, Nakamura M, Hirohata R, Ueno A, Ohishi M, Sakuma T, Soga T, Yamamoto T, Woltjen K.
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 9 ページ: 939
  • DOI: 10.1038/s41467-018-03044-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes (2018)
  • 著者名/発表者名: Shukunami C, Takimoto A, Nishizaki Y, Yoshimoto Y, Tanaka S, Miura S, Watanabe H, Sakuma T, Yamamoto T, Kondoh G, Hiraki Y.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 8 ページ: 3155
  • DOI: 10.1038/s41598-018-21194-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of D1-1 TALEN isogenic control cell line from Dravet syndrome patient iPSCs using TALEN-mediated editing of the SCN1A gene (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Sone T, Higurashi N, Sakuma T, Suzuki S, Ishikawa M, Yamamoto T, Mitsui J, Tsuji H, Okano H, Hirose S.
  • 雑誌名: Stem Cell Res 巻: 28 ページ: 100-104
  • DOI: 10.1016/j.scr.2018.01.036
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Unexpected heterogeneity derived from Cas9 ribonucleoprotein-introduced clonal cells at the HPRT1 locus (2018)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Mochida K, Nakade S, Ezure T, Minagawa S, Yamamoto T.
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 23 ページ: 255-263
  • DOI: 10.1111/gtc.12569
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tailor-made gene silencing of Staphylococcus aureus clinical isolates by CRISPR interference (2018)
  • 著者名/発表者名: Sato'o Y, Hisatsune J, Yu L, Sakuma T, Yamamoto T, Sugai M.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 13 ページ: e0185987
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0185987
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genome editing for dissecting and curing human genetic diseases (2018)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Yamamoto T.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 63 ページ: 105
  • DOI: 10.1038/s10038-017-0380-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted knock-in of an scFv-Fc antibody gene into the hprt locus of Chinese hamster ovary cells using CRISPR/Cas9 and CRIS-PITCh systems (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawabe Y, Komatsu S, Komatsu S, Murakami M, Ito A, Sakuma T, Nakamura T, Yamamoto T, Kamihira M.
  • 雑誌名: J Biosci Bioeng 巻: 125 ページ: 599-605
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2017.12.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cancer induction and suppression with transcriptional control and epigenome editing technologies (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakade S, Yamamoto T, Sakuma T.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 63 ページ: 187-194
  • DOI: 10.1038/s10038-017-0377-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] ALC1/CHD1L, a chromatin-remodeling enzyme, is required for efficient base excision repair (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsuda M, Cho K, Ooka M, Shimizu N, Watanabe R, Yasui A, Nakazawa Y, Ogi T, Harada H, Agama K, Nakamura J, Asada R, Fujiike H, Sakuma T, Yamamoto T, Murai J, Hiraoka M, Koike K, Pommier Y, Takeda S, Hirota K.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 12 ページ: e0188320
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0188320
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Modification of single-nucleotide polymorphism in a fully humanized CYP3A mouse by genome editing technology (2017)
  • 著者名/発表者名: Abe S, Kobayashi K, Oji A, Sakuma T, Kazuki K, Takehara S, Nakamura K, Okada A, Tsukazaki Y, Senda N, Honma K, Yamamoto T, Ikawa M, Chiba K, Oshimura M, Kazuki Y.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 7 ページ: 15189
  • DOI: 10.1038/s41598-017-15033-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment of pten knockout medaka with transcription activator-like effector nucleases (TALENs) as a model of PTEN deficiency disease (2017)
  • 著者名/発表者名: Matsuzaki Y, Sakuma T, Yamamoto T, Saya H.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 12 ページ: e0186878
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0186878
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] TALEN-mediated targeted editing of the GDE5 gene suppresses fibroblastic cell proliferation (2017)
  • 著者名/発表者名: Nakamura M, Kumrungsee T, Sakuma T, Yamamoto T, Yanaka N.
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 巻: 81 ページ: 2164-2167
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1373593
  • 査読あり
• [雑誌論文] Magic wands of CRISPR-lots of choices for gene knock-in (2017)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Yamamoto T.
  • 雑誌名: Cell Biol Toxicol 巻: 33 ページ: 501-505
  • DOI: 10.1007/s10565-017-9409-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] PAX2 is dispensable for in vitro nephron formation from human induced pluripotent stem cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Kaku Y, Taguchi A, Tanigawa S, Haque F, Sakuma T, Yamamoto T, Nishinakamura R.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 7 ページ: 4554
  • DOI: 10.1038/s41598-017-04813-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Parallel generation of multiplex knock-in cell collections using CRISPR-Cas9 assisted by locally enhanced MMEJ (2018)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Sakuma, Shota Nakade, Keiji Mochida, Kazuki Nakamae, Tomomi Aida, Kohichi Tanaka, Naoaki Sakamoto, and Takashi Yamamoto
  • 学会等名: The 9th Takeda Science Foundation Symposium on PharmaSciences
  • 国際学会
• [学会発表] Biased genome editing using the LoAD (local accumulation of DSB repair molecules) system (2018)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Sakuma, Shota Nakade, Keiji Mochida, Kazuki Nakamae, Tomomi Aida, Kohichi Tanaka, Naoaki Sakamoto, and Takashi Yamamoto
  • 学会等名: Precision Genome Editing with Programmable Nucleases - Keystone Symposia
  • 国際学会
• [学会発表] Updated summary of genome editing technology (2017)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Sakuma
  • 学会等名: 11th International Symposium on Nanomedicine (ISNM2017)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] がん抑制およびがんモデリングのための人工転写調節技術の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐久間 哲史
  • 学会等名: 第２回日本遺伝子細胞治療学会若手研究会セミナー
• [学会発表] Recent advances in gene knock-in techniques for cultured cell engineering (2017)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Sakuma, Shota Nakade, and Takashi Yamamoto
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会 (ConBio2017)
• [学会発表] Recent advances in genome editing technology (2017)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Sakuma
  • 学会等名: The 23rd Annual Meeting of Japan Society of Gene and Cell Therapy (JSGCT2017)
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集の技術開発と培養細胞での利用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐久間 哲史
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第２回大会
• [学会発表] Cas9 RNP導入細胞のクローン化に伴うheterogeneityの解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐久間 哲史、持田 圭次、中出 翔太、江連 徹、皆川 吉、山本 卓
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第２回大会
• [学会発表] CRISPR-Cas9によるゲノム編集とヒト疾患解析・治療への応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐久間 哲史
  • 学会等名: 第57回日本呼吸器学会学術講演会
  • 招待講演
• [図書] RNAi and Small Regulatory RNAs in Stem Cells - Methods in Molecular Biology (2017)
  • 著者名/発表者名: Takata N, Sakakura E, Sakuma T, Yamamoto T.
  • 総ページ数: 24
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-1-4939-7106-0
• [図書] Genome Editing in Animals - Methods in Molecular Biology (2017)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Yamamoto T.
  • 総ページ数: 12
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-1-4939-7127-5
• [備考] 広島大学 分子遺伝学研究室
  • URL: http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/index.html
• [産業財産権] 標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物、およびその利用 (2018)
  • 発明者名: 山本 卓、佐久間 哲史、國井 厚志
  • 権利者名: 国立大学法人広島大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2018-041322