| 研究実績の概要 |
本研究は、分裂期染色体タンパク質の大規模解析を通して見出した、新規染色体タンパク質、特にセントロメア・キネトコアタンパク質の機能解析を目的とするものである。そのために、CRISPR/Cas9を用いて、新規キネトコアタンパク質MKT4、あるいは新規セントロメアたんぱく質AIR-0,1を欠失した細胞をヒトHeLa細胞より作成した。それぞれのノックアウト細胞の表現型を蛍光免疫染色等の細胞生物学的な手法により解析することで下記に述べる新規タンパク質の機能の一端を明らかにした。
MKT4のノックアウトは、分裂期における強い表現型を示すことはなかった。しかし、MKT4を過剰発現する安定細胞株を作成し、その表現型を観察すると、通常は分裂期に異常は見られない。しかし、微小管合成阻害剤であるノコダゾールを添加した場合、細胞は分裂期で同調せず、細胞死が引き起こされた。野生型ではノコダゾールを添加した場合、スピンドルチェックポイント(SAC)が働き、細胞は分裂期で同調する。この事実から、MKT4 がSACに負に作用していることが示唆された。また、MKT4のノックアウト細胞が表現型を示さない事実について、MKT4のノックアウト細胞作成時の長期培養が、MKT4をレスキューする経路を活性化した可能性を考え、オーキシンの添加によるコンディショナルノックアウト細胞の作成し、表現型を観察することを試みている。
AIR-0,1に関しては、HP1とCENP-Bのそれぞれに結合するドメインを同定し、その２つの結合がAIR-0,1のペリセントロメア局在を決定していることを示すことができた。この研究で作成した種々のHP1欠失変異体を用いて、染色体パッセンジャー複合体の新規活性化経路を示すことができた。
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