研究課題
1．構造解析に適したNKRP1Aの調製及び構造解析これまで立体構造解析に十分な量の組換えNKRP1A蛋白質が調製できていなかった。昨年度に続き、丹念な変異体作製を行うことでこの問題の打開を試みた。変異は相互作用に影響がないと予想される位置でかつ安定に調製できることが報告されているマウス由来Nkrp1と保存性の低い部位に導入した。昨年度見出した巻き戻り効率が野生型に比べて向上した変異体について、更に巻き戻し、ゲル濾過クロマトグラフィーの条件を丹念に検討することで複数の変異体で収量が当初の1.5倍から数倍程度に改善した。これら変異体について円偏光二色性スペクトル測定による構造解析を行ったところ、野生型について解析できていないものの、いずれもαーβ蛋白質を反映するスペクトルを示した。NKRP1Aが属するC型レクチンはαへリックスとβシートで構成されており、調製したNKRP1Aが正しい構造をとっていることが示唆された。複合体のX線結晶構造解析を目指し、結晶化に着手したが、X線回折実験を実施するのに適当な良質な単結晶が得られなかった。2．NKRP1AとリガンドLLT1の網羅的な相互作用解析昨年度に引き続き、既に確立されている安定なLLT1の変異体と哺乳細胞発現系により粗精製したNKRP1Aを用いた表面プラズモン共鳴法によりNKRP1AとLLT1の相互作用解析を実施した。NKRP1A変異体およびNKRP1A変異体とLLT1変異体を用いた相互作用解析の結果、LLT1構造に基づき新たに提唱したNKRP1A－LLT1複合体モデルにて見出された相互作用領域に点在する多くのアミノ酸残基が結合に重要であることが明らかになった。一方、明確な結合のホットスポットが見出せなかったため、現在のモデルの結合面にズレがあることが示唆された。このズレを考慮した変異体を新たに作製し相互作用解析を実施した。
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The Journal of Biological Chemistry
巻: 292 ページ: 6438-6451
10.1074/jbc.M117.779686.
