| 研究課題/領域番号 |
16K18500
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
金井 隆太 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (50598472)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 / イオンポンプ / 膜蛋白質 / パリトキシン |
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| 研究実績の概要 |
パリトキシンはナトリウムポンプの能動輸送を阻害し、チャネル化する海産毒物である。その作用機序を明らかにするために、パリトキシンと結合したナトリウムポンプの構造解析に取り組んでいる。逆反応から得たE2P状態でパリトキシン(PTX)と結合したナトリウムポンプの結晶構造解析について、既に低分解能の回折データを得ていた。平成28年度では結合したパリトキシンの構造の全容解明を目指して、① 高分解能データの収集、② パリトキシンと結合していないE2P状態の結晶化及び構造解析、③ 重原子を用いた実験位相の決定による構造解析、④E2P状態とは異なる状態でのパリトキシン複合体の結晶構造解析に取り組んだ。①について結晶化条件の最適化を継続して行い、わずかな改善はみられるものの、3 Åを超える回折データの収集には至っていない。②については結晶化に成功し、同程度の分解能を得ることができた。Fo(PTX-bound) - Fo(PTX-unbound)電子密度マップの結果、PTX結合に伴うNa+ポンプの構造変化が明瞭になり、PTXと思われる電子密度マップが確認できた。現在、パリトキシンの部分的なモデリングに成功している。③については重原子置換体の調製に困難を極めたが、これまでに4種類の重原子置換体結晶のデータ収集に成功した。④について、いくつかの状態との複合体の結晶化を目指していたところ、当初、困難と予想された、より学術的に重要なNa+結合状態の結晶化と低分解能での構造決定に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では28年度中に逆反応から得たE2P状態でPTXと結合したナトリウムポンプの結晶構造の決定を目指していたが、上記のように結合したPTXの構造全体の解明には至っていない。その大きな原因は、蛋白質試料を供給してくれていたデンマークAarhous大学のBente Vilsen教授らで実験設備が故障し、また技術職員の入れ替えで不慣れな試料調製により28年度前半は試料の供給が停止してしまい、実験ができなかったことである。現在では安定的に試料を供給してもらっており、当初の計画にはまだ追い付いていないものの、実験自体は順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、3 Åを超える分解能が得られるように結晶化条件の最適化に取り組むと同時に、③で得られている重原子置換体のデータを解析、また②で得られたEP単独状態との構造比較からPTX全体の構造決定を目指す。また、④で得られたNa+結合状態の結晶化について、PTXと結合したものは勿論だが、単独状態でも学術的価値が非常に高いため、それらの結晶化条件の最適化と構造決定にも同時に取り組んでいく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本課題を進めるにあたって必要な蛋白質試料はデンマークAarhous大学のBente Vilsen教授らより供給されているが、平成28年度前半にてVilsen教授らの実験設備の故障および人材の入れ替えで蛋白質試料の供給が停止し、約半年間、本課題を進められなくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在では試料が安定的に供給されて研究は順調に進んでおり、課題を達成できるようにエフォートの配分を増やして取り組んでいく。それに伴い、28年度に使用されなかった研究費は今年度の実験全般の経費、またSPring8(兵庫県), PF(茨城県)での回折データ測定のための旅費に充てて、課題遂行のスピードアップを図る。
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