| 研究課題/領域番号 |
16K18501
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
松井 崇 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (30463582)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | プレニル基転移酵素 / 放線菌 / 結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
プレニル基転移酵素（PT）によって修飾された天然化合物は母骨格化合物にはない強力な生物活性を示すものがある。PTのうち、インドールへプレニル基を修飾可能なプレニル基転移酵素（IPT）は、非天然化合物の生合成研究や結晶構造解析が進められているものの、IPTによる効率的な物質生産へは応用できていない。そこで、本研究では、IPTの中でもこれまで構造解析がされておらず、またその機能についても詳細が不明であった新規IPTの立体構造や基質・酵素反応生成物を同定する。さらに、既知IPTと比較することで基質特異性を発揮する構造要素を解明し、効率的に有益物質を生産可能な変異型IPTの創出を目指す。本目的を達成するために、平成29年度では、前年度に放線菌より同定した新規IPTの基質特異性や結晶構造解析に向けた結晶化を行った。
既に平成28年度においてIPTの初期結晶を得ていた。しかし、精製条件を変更しただけでは高分解能結晶を得ることができなかったため、平成29年度はN末端HisタグからC末端HisタグやN末端GSTタグへの変更とタグを切断可能な酵素認識サイトの付加を試みた。しかし、タグの変更により不溶化や発現量の低下が見られ、IPTのNまたはC末端の数残基を欠損させたN末端Hisタグ欠損体を調製と結晶化を進めている。
一方、IPTの酵素反応解析では、基質と予想されるインドールとファルネシル二リン酸を用いた酵素反応条件を検討した。その結果、20℃、pH 8.0条件下で最も効率よく生成物が産生された。
さらに、IPTの基質特異性を確認するために、複数の基質候補化合物を用いて酵素反応を試験した。現在まで、L-Trpやトリプタミンなどのインドール環を持つ化合物に対して本IPTはファルネシル基を付加できず、当初の推測どおり本IPTが基質特異性IPTである可能性を示す結果を得ることに成功している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年5月に現在の所属へ異動し、また、研究室の立ち上げに関わったため、当初予定していた計画よりも実際の進捗状況は遅れ気味である。
各種実験機器の導入や研究環境の整備、遺伝子組換え申請等が受理され、現在は研究室の立ち上げがほぼ終了し、概ね実験は軌道に乗り始め、H29年度に完了予定だったIPTの酵素反応解析は当初予定に近い進捗状況まで遅れを取り戻す事ができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、複数のNまたはC末端欠損体の調製を行っており、これらの結晶化に取り組むことで基質特異性IPTの構造解析を目指す。また、酵素反応試験についても、今後、プレニル供与体の基質特異性を確認し、また、立体構造をもとに触媒領域のアミノ酸変異体を調製することで、触媒残基と基質結合に重要な残基の特定を進め、基質寛容性IPTのそれと比較することで基質特異性を発揮する真の残基の同定を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2017年5月に現在の所属に転出し、また、現在の所属研究室の立ち上げに関与し、当初計画より遅れたため。
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