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Toll様受容体TLR9のリガンドである非メチル化CpG DNAは強力な自然免疫活性化能と簡便に作成できる点で新規アジュバントとして注目されている。しかし、「マウスと霊長類での反応性の違い」や「CpG DNA 配列による反応性の違い」など動態差がなぜ生じるのか不明な点がある。本申請課題では、主としてＸ線結晶構造解析による立体構造に基づきヒト由来TLR9の種特異的な基質認識に関わる分子メカニズムの解明を目指した。本年度では、下記項目の研究計画を実施した。
1. 発現系の改良：これまでに確立した蛋白質調製法では、昆虫細胞-バキュロウイルス発現系を用いていたが、クライオ電子顕微鏡による観察の結果、精製タンパク質（膜ドメインを含むヒト由来TLR9）の分子構造には高い不均一性が認められた。このため、BacMamウイルスを利用した哺乳動物細胞HEK293s GnTi-での発現系構築を進め、高い構造均一性の得られる試料調製法の検討を行った。これまでのところ、高収量・高純度に蛋白質調製に成功した。今後、クライオ電子顕微鏡による粒子観察を進める。
2. 結晶化条件探索： 昆虫細胞発現系および哺乳動物細胞発現系から調製した精製試料について、これまでと同様に多数の結晶化条件の探索を進めているが、これまでのところ結晶を得ることはできていない。
3. 種特異的基質認識：ヒトとマウス由来TLR9細胞外領域の相同性は約74%である。基質特異性を決定する領域を特定するため、ヒト由来TLR9細胞外領域の一部をマウス由来TLR9領域に組換えたキメラ体（細胞外領域のみ）を14種類作製し、昆虫細胞発現系により試料調製を行った。今後は、等温滴定カロリメトリーによる基質との相互作用解析を進め、領域決定を行う。
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