|
ユビキチン化酵素Nedd4Lとアダプター分子ARRDC1は基質分子のユビキチン化とエンドサイトーシスに関与するが詳細は不明である。本研究では小胞形成と共役したNedd4Lの活性化機構におけるARRDC1の役割の解明を目的としている。
平成28年度はARRDC1が小胞の細胞膜リン脂質に結合する機構を解析した。そこで平成29年度はNedd4Lの活性化とそれに伴う基質分子のユビキチン化、エンドサイトーシスにおけるARRDC1と小胞の役割を調べた。
＜細胞内でのNedd4L活性化の評価＞ Nedd4L活性化におけるARRDC1の関与を細胞レベルで調べるため、Nedd4Lの自己ユビキチン化を指標とした細胞アッセイ系の確立を目指した。しかしHEK293細胞にNedd4LとARRDC1を発現させるとNedd4Lのユビキチンリガーゼ活性依存的にNedd4LとARRDC1のタンパク質量が減少したことから、共発現システムを用いたアッセイ系は実行困難になった。そこで間接的な評価として基質分子のエンドサイトーシスを指標としてARRDC1の関与を調べた。HeLa細胞に様々なARRDC1変異体を発現させ、基質分子のエンドサイトーシスを調べた。そしてNedd4Lを介した基質分子のユビキチン化とエンドサイトーシスにはARRDC1とNedd4L、またARRDC1と細胞膜リン脂質との結合が必須であることが示唆された。
＜試験管内でのNedd4L活性化の評価＞ Nedd4Lの活性化機構をさらに詳しく解明するため、試験管内でのNedd4L活性化再構築実験を行った。これによってNedd4Lによる基質分子のユビキチン化のARRDC1依存性、ARRDC1の膜結合依存性、基質分子の膜局在依存性、小胞のサイズ依存性が明らかになった。
|
