| 研究課題/領域番号 |
16K18534
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
小島 理恵子 山形大学, 理学部, 助教(個別契約任期付教員) (60769652)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ERMES / ミトコンドリア / オルガネラコンタクト |
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| 研究実績の概要 |
近年，異なるオルガネラ同士が膜コンタクトサイトを形成し，機能的に連携することが明らかとなり，その重要性と役割が着目されている。ミトコンドリア外膜と小胞体膜の一部を物理的に結合させるタンパク質複合体として同定されたERMESは，欠損すると酵母において強い増殖阻害を引き起こし，ミトコンドリアの形態やリン脂質組成に異常を示すことが分かっているが，その機能について明確なコンセンサスが得られていなかった。
我々は昨年度，ERMESが小胞体からミトコンドリアへのホスファチジルセリン (PS)の輸送に直接的に関与していることを，独自に開発したin vitro PS transport assayを用いて明らかにした。今年度は，ERMES構成因子であるMdm12の疎水性ポケットにリン脂質が結合することや，ERMES構成因子Mmm1-Mdm12複合体がリン脂質輸送のミニマムユニットとして機能することを，X線結晶構造解析やin vitro PS transport assayを用いてを明らかにし，その成果をJournal of Cell Biology誌に共著で発表した。また，酵母細胞やヒト培養細胞で，異なるオルガネラ移行シグナルをつけたSplit-GFPを発現させることで，異種オルガネラ膜間コンタクトを蛍光顕微鏡で観察するシステムを開発し，その成果をScientific Reports誌に共著で発表した。
また，我々が昨年度までに同定したERMES欠損株の増殖阻害を回復させる４つのマルチコピーサプレッサー遺伝子のうち，機能未知のYgr250cについて，相互作用パートナータンパク質を免疫沈降法により同定するため，Ygr250cの大腸菌発現系構築を試みたが，発現は確認できるものの分解産物が多く，安定した精製産物を得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ERMES構成因子であるMdm12の疎水性ポケットにリン脂質が結合することや，ERMES構成因子Mmm1-Mdm12複合体がリン脂質輸送のミニマムユニットとして機能することを，X線結晶構造解析や我々が独自に開発したIn vitro PS transport assayを用いてを明らかにし，その成果をJournal of Cell Biology誌に共著で発表した。また，酵母細胞やヒト培養細胞で，異なるオルガネラ移行シグナルをつけたSplit-GFPを発現させることで，異種オルガネラ膜間コンタクトを蛍光顕微鏡で観察するシステムを開発し，その成果をScientific Reports誌に共著で発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々が同定したERMES欠損株の増殖阻害を回復させる４つのマルチコピーサプレッサー遺伝子（Kojima et al., FEBS Lett., 2016）のうち，機能未知のYgr250cについて解析を行う。N末端領域に保存された領域があり，この領域と相互作用するタンパク質が存在している可能性が考えられるため，相互作用パートナーを探索する。免疫沈降を用いて相互作用パートナーを探索するために，今年度はN末端領域のコンストラクションを複数作成し，大腸菌発現系を用いて大量発現系の構築を試みたが，発現はするもののいずれも分解産物が多く，安定したリコンビナントYgr250cを得られなかった。そこで，異なるコンストラクションを作成し，うまく精製できた場合は，酵母から抽出したトータルライセートを使って免疫沈降を行い， MS解析と組み合わせて相互作用パートナーの同定を試みる。うまくいかなかった場合は，化学架橋やin vivo部位特異的光架橋を用いて相互作用パートナーを探索する。パートナーが同定できた場合は，その機能解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定の消耗品が割引のため少し安く購入できたため。
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