| 研究課題/領域番号 |
16K18551
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
松花 沙織 神戸大学, 理学研究科, 特命助教 (70767251)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 心臓神経堤細胞 / 遺伝子制御ネットワーク |
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| 研究実績の概要 |
神経堤細胞は胚発生初期に生じる多分化能と移動能をもつ細胞群である。これらは神経管形成期に背側神経管から生じ、胚内を遊走し、さまざまな細胞種へと分化する。神経堤細胞はその由来する領域によりいくつかのサブグループに分けられる。その一つである心臓神経堤細胞は、耳胞から第３体節に位置する神経堤領域から生じ、大動脈管や副甲状腺、胸腺、心臓流出路、心臓の大動脈と肺動脈の隔壁などをつくる。
多分化能を有する神経堤細胞の分化運命決定には、移動の時期や経路が大きく影響する。しかし、心臓神経堤細胞だけは例外であり、他の神経堤細胞とは異なる分化決定機構を持つと考えられる。本研究の目的は心臓神経堤細胞の独自性を生み出すメカニズムを解明することである。その目的を達成するため、ニワトリ胚を用いて下記の3つの課題に取り組んでいる。
(1)主に心臓神経堤遺伝子欠失胚を用いた神経堤マーカー遺伝子の発現様式の解析により、心臓神経堤遺伝子の機能とその制御ネットワークを明らかにする。(2)心臓神経堤遺伝子の強制発現により他領域神経堤の遺伝子プログラムを心臓神経堤型へと変換できる心臓神経堤キー遺伝子を特定する。(3)プログラム変換された神経堤の細胞分化能を知るため、心臓神経堤キー遺伝子を用いて細胞リプログラムの検証を行う。
これらの解析を通して、心臓神経堤遺伝子により構築されている遺伝子制御ネットワークを明らかにし、心臓神経堤細胞の特殊な細胞分化決定機構を解明を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度はこれまでに同定した心臓神経堤遺伝子の機能解析を行うため、モルフォリノオリゴを用いたノックダウン実験を行った。この胚を用いて、in situハイブリダイゼーションや免疫染色による神経堤マーカーの発現を検出したところ、心臓神経堤細胞において著しいシグナル低下が見られた。またこの遺伝子のドミナントネガティブ型変異体コンストラクトを作製し、強制発現させた胚においても、同様の結果が得られた。
よってこの心臓神経堤遺伝子が心臓神経堤細胞の発生に重要な役割を果たしていること、さらに他の神経堤遺伝子の発現制御に関わっていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在解析を進めている心臓神経堤遺伝子がどのようにして神経堤マーカー遺伝子の発現制御に関わっているのかを明らかにする。神経堤マーカー遺伝子であるsox10やFoxD3は神経堤特異的エンハンサーがすでに同定されており、これらを蛍光蛋白質発現ベクターに導入したレポーターコンストラクトが作製されている。これを利用し、心臓神経堤遺伝子の機能欠失胚やドミナントネガティブ変異体におけるレポーター活性を解析する。レポーター活性に変化が見られた場合は、そのレポーター発現が直接転写制御によって影響を受けているのかについて調べるために、まずこのエンハンサー内に心臓神経堤遺伝子の結合モチーフが存在するかを調べる。結合モチーフの存在を確認した場合には、その部位に塩基置換を挿入した変異レポーターを作製し、ニワトリ胚内でその変異レポーター活性を検証する。
また他の心臓神経堤遺伝子についても、モルフォリノオリゴを用いたノックダウン胚を作製し機能解析を行うことで、心臓神経堤細胞における遺伝子制御ネットワークを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では心臓神経堤遺伝子のノックダウン実験に使用するモルフォリノオリゴ（１種あたり約10万円）を多数の遺伝子に対して設計・発注し、解析に使用する予定であった。しかし、心臓神経堤細胞の形成に重要な役割を果たしている候補遺伝子を、早期に見いだすことができた。平成28年度はまずこの遺伝子に焦点を絞り、ドミナントネガティブ変異体コンストラクトの作製及びその導入胚を用いて、より詳細な機能解析を優先させたため、モルフォリノオリゴ購入予算の一部を次年度に繰り越すことにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度にはまだ着手できていない心臓神経堤遺伝子の機能解析も進めて行く予定である。まずはこれらの遺伝子に対するモルフォリノオリゴを設計・発注し、ニワトリ胚で導入したノックダウン胚を作製する。この胚における神経堤マーカー遺伝子の発現解析を通して、心臓神経堤細胞におけるそれぞれの遺伝子の機能を明らかにする。
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