| 研究課題/領域番号 |
16K18587
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
蛭田 千鶴江 岩手医科大学, 教養教育センター, 助教 (20723018)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ミジンコ / 単為生殖 / 減数分裂 / ゲノム編集 / ノックイン |
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| 研究実績の概要 |
単為生殖種は、卵形成に必須である減数分裂機構を獲得してからそれぞれの分類群において独立に単為発生機構を獲得している。本研究では、その単為発生機構を「体細胞分裂から減数分裂への進化に至る疑似的な中間段階」とみなすことで、単為発生機構の研究から減数分裂の成立過程と本質に迫ることを目指している。今回研究対象とするミジンコの単為発生卵形成でみられる「減数しない減数分裂」の過程が減数分裂をどのように改変させたものなのかを明らかにする事を目的に、次の2点からアプローチを行った。
まず1点目は、ミジンコの単為発生卵が形成される過程の分裂装置の動態を詳細に解析するために、分裂装置を構成する標的タンパク質の下流にEGFPを挿入したレポーターミジンコの作出を目指した。標的染色体領域への正確な遺伝子挿入が可能なシステムであるTAL-PITCh法を用いたが、導入するドナーベクター内のカセットの種類や濃度などの条件検討に時間を要した。これらをゲノム編集学会にて報告し、得られた有益な情報を参考にミジンコでノックイン法が機能するよう、ドナーとしてPCR産物を用いるなど代替法も取り入れながら問題解決に取り組んでいる。
2点目は、卵形成時の分裂の制御を目指して、脊椎および無脊椎動物においてその関与が報告されているMos-MAPK経路に着目した。すでにミジンコにおいてもMAPKの活性化／不活性化が分裂の停止／進行へ関与することを示唆する予備実験結果が得られている。そこで、Mos-MAPK経路の阻害剤処理により、人為的に分裂が制御できるか実験した。その結果、阻害剤はミジンコにも効果的であることが示唆されたが、安定的な結果を得るに至っていない。現在、阻害剤処理の濃度や時間などの条件検討と共に、リン酸化MAPK抗体を用いた免疫染色により各分裂過程でのMAPKの活性化状態の詳細な解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
以下2点の理由で進捗がやや遅れている。1点目は、所属機関の変更による使用実験機器の移送に伴い実験を一部停止したため。2点目は、単為発生機構の解析方法として、卵形成時の分裂に関わるタンパク質を蛍光標識した個体を作出する予定であったが、そのノックイン法の確立に課題が生じ、解決のための時間を要しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノックイン法については、現状で考え得る解決方法に取り組んでいるところである。さらに、解決しない場合も想定して、TALENだけではなくCRISPR/Cas9を利用したノックイン法にも並行して取り組む予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属機関の変更および実験計画の遅れにより、当初の使用計画から変更が生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
まず、研究遂行に必須の実験機器のうち所属機関の異動により代替品がないものについては、レンタルまたは購入をするため、その費用に充当する。さらに、ノックイン法の確立に必要なゲノム編集用の試薬・消耗品へ充当する。ノックイン法を確立後は、単為生殖様式の分子メカニズム解析に必要な試薬、消耗品、飼育器具に充当する。また、成果報告のための学会参加や論文校正および投稿費用にも支出する予定である。
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