| 研究課題/領域番号 |
16K18588
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| 研究機関 | 立教大学 |
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研究代表者 |
小田原 真樹 立教大学, 理学部, 助教 (40460034)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 葉緑体 / 組換え / ヒメツリガネゴケ |
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| 研究実績の概要 |
今年度は主に葉緑体におけるDNA組換え活性を測定するための系の構築を行った。まずCre-loxPシステムを用いた葉緑体型RECA2遺伝子の条件的破壊株の構築を行った。当初はゲノム上のRECA2遺伝子を、loxPサイトで挟んだRECA2 cDNAで置換する形で条件的破壊株を構築したが、非破壊時でも既にRECA2転写産物量が野生株に比べて著しく少ないことが判明した。そこでゲノム上のRECA2遺伝子イントロン内部と下流にそれぞれloxPサイトを導入し、Creの誘導によってRECA2遺伝子の後半が欠失するコンストラクトに変更した。構築した条件的破壊株は、非破壊時にはRECA2転写産物が野生株と同レベルであり、エストロジェンの添加でCre発現を誘導させることによってRECA2遺伝子が破壊され、通常のRECA2破壊株と同等の表現型を示すことを確認した。
葉緑体に様々な長さの反復配列を導入するためのコンストラクトに関しては、全ての種類を完成させることができた。これらのコンストラクトをヒメツリガネゴケの野生株葉緑体に導入し、形質転換体を得ることができた。しかしながら、おそらく葉緑体内での組換え活性が非常に高いことが原因で、形質転換体の選抜に用いるスペクチノマイシンの濃度を下げると、反復配列間の組換えによって、反復配列間に配置したスペクチノマイシン耐性マーカーが抜け落ちてしまうことが判明した。この対策として選抜中はスペクチノマイシン濃度を高く保ち続けることにした。現在この新たな条件での形質転換体の選抜を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
構築したRECA2条件破壊株が、非破壊時にすでにRECA2転写産物量が著しく低下していることが判明したため、新たな条件破壊株の構築に時間を要した。また、人工的反復配列を葉緑体ゲノムに組み込む際に、選択に用いるスペクチノマイシンの濃度が不十分であると、反復配列間に配置した選択薬剤マーカーが組み換えによって抜け落ちてしまうことが判明した。この対策としてのスペクチノマイシン濃度の検討に時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
葉緑体ゲノムに導入した反復配列間の組換えによって、間に挟んだ薬剤マーカーが抜け落ちやすい。これは、スペクチノマイシン濃度を高く保つことによって、組換えによるマーカーの脱落を防ぐことができると期待できる。しかしながらスペクチノマイシン濃度を高くしても反復配列間の組換えによるマーカーの脱落を抑制できない場合は、マーカーのプロモーター部位の改変等によって薬剤耐性を弱め、スペクチノマイシンによる選択圧を相対的に強くする。
現在用いているPEGによる葉緑体形質転換法は効率が悪いため、パーティクルガンによる葉緑体形質転換を試み、作業の効率化を図る予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
葉緑体ゲノムにおける組換え測定系構築が遅れたために、組換え測定に用いる一部試薬の購入を見送った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
葉緑体ゲノムにおける組換え測定系の構築ができ次第、組換測定に用いる試薬を購入する予定である。
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