深海環境における貧栄養性好圧菌の実態を探る

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K18611
• 研究機関: 国立研究開発法人海洋研究開発機構
• 研究代表者: 宮崎 征行 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 深海・地殻内生物圏研究分野, 技術副主任 (50399573)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 高圧連続培養 / 好圧菌 / 貧栄養微生物

研究実績の概要

本研究は、バッチ式でしか微生物の培養することができなかった高圧培養において、高圧連続培養装置を開発し、より自然な環境を再現した状態での培養を可能にすることで、ほとんど認識できていない好圧性の貧栄養性菌や独立栄養性菌の存在を明らかにする。そこで連続培養式の高圧容器を開発し、培養が困難であるが故に知見の少なかった好圧性菌の多様性を明らかにすることを目的とする。
平成29年度は初年度に製作した高圧連続培養装置について超純水を用いた２週間以上の通水試験を行い、その後実サンプルを用いた連続培養を行う事を予定した。結果として、超純水を用いた通水試験で２，３日を経過したぐらいから、配管の継手部分や培養装置本体からの水漏れが発生した。そのため、継手部分のシーリングやパッキン素材の見直しを行った。また、使用している高圧プランジャーポンプには異常発生時の停止機能が無く、漏水してもそのまま送液を継続してしまった。そのため漏水検知器を導入し、漏水時の装置停止機能を追加した。これらの処置により35MPaで2週間程運転を行ったが、水漏れの発生もなく順調に装置は稼働した。
一方、海洋表層の溶存酸素濃度と比べて深海環境の溶存酸素濃度は低い事から、供給する培地の酸素濃度の調整が必要となると判断した。そのため、既存のファーメンターにDOセンサーを取り付ける事で一定の酸素濃度を供給が可能となる事から、培地の供給にはファーメンターを用いる事とした。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

高圧連続培養装置の漏水トラブル対応や所属機関の業務増加等の事情により、平成29年度に着手する予定であった深海サンプルを用いた培養実験に着手出来ていないため、遅れていると判断する。

今後の研究の推進方策

装置の長期運転、培地中の溶存酸素濃度の供給方法が確立された事から、両装置を接続し高圧連続培養装置を完成させる。その後、実サンプルを用いての培養実験を行う。培養途中の培養液の化学分析を行い、その結果に基づいて微生物の増殖を確認する。微生物種の確認の為、DNAおよびRNAを抽出し、PCRにより16S rRNA遺伝子の増幅後、クローン化を行うことで塩基配列を得る。得られた配列は系統解析ソフトARBを用いて解析を行い、構成種を明らかにする。もし、増殖した微生物の多様度が高かった場合、次世代シーケンサーを用いて解析を行い統計学的検討も行う。

次年度使用額が生じた理由

高圧連続培養装置のセットアップの遅れから、培養実験を行っていない。培地や遺伝子解析用の試薬関係の購入を差し控えたため、次年度使用額の変更が生じた。
（使用計画）平成30年度に培養試薬及び遺伝子解析に用いる費用について使用する予定である。