| 研究課題/領域番号 |
16K18670
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
解良 康太 東北大学, 工学研究科, 助教 (30644546)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | シアノバクテリア / c-di-GMP / 二成分制御系 / バイオフィルム |
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| 研究実績の概要 |
ラン藻（Synechocystis sp.PCC6803）は、ゲノム解読された光合成生物のモデル生物であり、環境の変化に伴い様々なストレス応答機構を有していることが推測される。本研究では、ラン藻が塩ストレス誘導性バイオフィルム形成機構を解明するべく、バイオフィルム形成を誘導するセカンドメッセンジャーc-di-GMPの生合成制御機構に着目し、生化学的なアプローチから解明することを目的とした。
ラン藻のポリアミン受容体と推定されるPotD、c-di-GMP生合成及び分解酵素と推定されるMbaAについて欠損株のバイオフィルム形成能解析及び酵素機能解析を行った。塩ストレスに曝した場合、mbaA欠損株はバイオフィルム形成量が少し低下した。このことからMbaAは塩ストレス誘導性バイオフィルム形成機構に関与するものの、寄与が限定的であることが示唆された。また、bacterial two-hybrid法によりPotD-MbaAの相互作用解析を行ったが、相互作用は観察されなかった。MbaAはc-di-GMP合成ドメインと分解ドメインの両方を有するハイブリッドタイプの膜タンパク質であるため、MbaAの全長、MbaAの親水性領域、c-di-GMP合成ドメイン、c-di-GMP分解ドメインのそれぞれについて大腸菌を用いて異種発現させ酵素精製を行った。MBPを融合させた場合全長MbaAは発現しなかった。一方、各ドメインの精製に成功したが、酵素活性は検出されなかった。昆虫細胞由来無細胞タンパク質合成系を用いて全長MbaAの発現に成功したが、酵素活性については検出できなかった。また、微生物の持つセンサーシステムとして広く知られている二成分制御系を介したc-di-GMPの生合成制御機構としてHik12-Rre2、Hik14-Rre8の詳細な酵素機能解析に向けてコンストラクトの作製を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MbaAを大腸菌で異種発現させた際に、封入体を作ったため可溶性タグの検討、変性からのリフォールディングなどを行う必要があった。また、無細胞系を用いてMbaAを調整することに多くの時間を要した。また、MbaAの活性測定をする過程で、基質に含まれないピークが検出されたが、このピークがMbaAの生産物なのか、夾雑タンパク質による副反応産物であるかをLC-MSを用いて検証することに時間を要した。このように、MbaAの異種発現が予想よりも困難であり、酵素機能解析に多少の遅れを生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでは、塩ストレス誘導性バイオフィルム形成におけるc-di-GMP生合成制御機構としてMbaAの介在する経路について解析を行ってきた。PotD-MbaAの相互作用解析について、相互作用を検出できなかった理由として、PotDの活性化にポリアミンの結合が必要であることが考えられる。そこで、解析を行う大腸菌のポリアミン生合成酵素を過剰発現させ、相互作用の再検討を行う。また、MbaAの酵素機能解析について、異種発現が困難であるため、欠損株及び相補株の菌体内c-di-GMP量を測定することで酵素機能について解析を進めたいと考えている。これらの実験に加え、平成29年度は二成分制御系を介したc-di-GMP生合成制御機構について、欠損株の相補実験、LC-MSによるラン藻菌体内のc-di-GMP量の測定、リン酸基リレーの解析を通して解析していく予定である。二成分制御系について、当初はHik12-Rre2、Hik14-Rre8について解析を進めていく予定であったが、その後の解析により新たにc-di-GMP生合成に関与する可能性の高い二成分制御系を見出した。そこで、計画案に加えて、新たに着目した二成分制御系についても欠損株を作製し、バイオフィルム形成解析及び酵素機能解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
PotDとポリアミンの相互作用解析について、他グループより報告があったため使用を予定していた放射性同位体の購入を控えた。また、MbaAの酵素機能解析に必要な基質及び標準物質の購入について、異種発現に遅れが生じている。そのため、当初予定していた消耗品の購入を見送り、当研究グループで少量所有しているものから使用しているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在保有している基質及びHPLC分析用のカラムを使い切ったためでは不十分であるため、現在遅延している実験を行うためには、購入を控えていたものについて手配を進める必要がある。また、二成分制御系の解析には、リン酸基リレーの解析に使用する放射標識されたATPが必須である。従って、当初二成分制御系の解析のために計上していた額に加え、遅延していた実験を遂行するための消耗品の購入費に使用する予定である。
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