| 研究課題/領域番号 |
16K18675
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
河野 祐介 筑波大学, 高細精医療イノベーション研究コア, 研究員 (40558029)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 硫黄代謝 / 大腸菌 / ペリプラズム / チオ硫酸イオン |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度には、IPTG誘導可能な大腸菌発現系プラスミドでPspEのC末端（ペリプラズム移行タンパク質のため）にHis tagを導入したコンストラクトを構築した。形質転換株を、IPTG誘導によりPspE-His_tagを大量発現させる培養を行い、その菌体破砕液からをNiアフィニティーカラムで精製した。現在、精製タンパク質の生化学的な活性を調べている。
一方で、LC-MSによる硫黄分子種メタボローム解析系の改良（検出対象分子種の拡充）も行った。例として、硫黄代謝（同化）における重要な中間体であるAPS(Adenosine 5'-phosphosulfate)の標品を用いて、MS/MSにおける検出条件（測定電圧、コリジョンエネルギー等）の最適化を行い、引き続き、現行メソッドでの溶出時間を決定し、この分子の検出プログラムとして追加した。
また、当課題のシーズとなった硫黄転移酵素の投稿論文についても提出し、現在リビジョンを行っている段階にある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、PspEの精製タンパク質におけるin vitroの酵素活性の基質特異性や反応キネティクス、ポリスルフィド状態を理解する部分までを計画していた。現在、タンパク質調製は、ほぼ完了したと言える状態で、酵素活性等の測定実験にも着手しているものの、その結果を結論とするには、もう少し実験（時間）を要するからである。その原因の一つとして、8月に研究代表者の所属機関の異動（8月）があったことに伴い、その前後で研究設備（主に培養機器）のセットアップや遺伝子組換え施設とての登録等があったことが挙げられる。当該期間には、上記のLC-MS測定系（主には平成29年度に利用予定）の改良をすることができたので、全体としての遅れは、ほぼないものと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、行っているPspE-His_tagタンパク質の特性解析を完了する。また、平成28年度に改良した、硫黄分子種のメタボローム解析系を活用して、各硫黄分子種を基質とした際の硫黄代謝動態を明らかにし、PspEのポリスルフィド状態を調べ、その生理的な意義の解明に向け推進する方策とする。これにより、平成30年度に取り組む、PspEとの関係が示唆される硫黄代謝フローに関わる遺伝子の破壊株での比較解析の基盤データとする。これには、H28年度に培養に関する実験が少なかったために生じた繰越金を、ディスポ器具などの効率よく実験を推進するための購入費用に充てて取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度、8月に、研究代表者の所属機関の異動があり、その前後で実験環境のセットアップに時間を要したため、特に培養実験の試行回数が計画より減った（ただし、代わりに解析系の改良は行っている。以上により、当年度の支出が減少した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度には、本年度の遅れを取り戻し、むしろ全体としては計画以上の進捗とするために、主に培養実験の効率的な実施に資する形で有効活用する（ディスポ器具類等）。
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