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2018 年度 実績報告書

DNA/RNAミスマッチ認識蛋白質を用いた高精度逆転写による相同miRNAの識別

研究課題

研究課題/領域番号 16K18680
研究機関大阪医科大学

研究代表者

福井 健二  大阪医科大学, 医学部, 助教 (00466038)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード逆転写反応 / ミスマッチ / タンパク質 / 高度好熱菌 / PCR
研究実績の概要

相同 miRNA 識別技術の構築を目指し, DNA/RNA ミスマッチ認識タンパク質の構造機能解析と, その応用法の開発を行った。高度好熱菌由来 BsbP タンパク質および MutS2 タンパク質を主要なターゲットとした。MutS2 タンパク質については, C 末端領域に存在するエンドヌクレアーゼドメインを除去した変異体を作製し, 研究に用いた。まず, DNA/RNA 結合能を調べたところ, BsbP タンパク質は DNA/DNA または DNA/RNA から成る 5 塩基以上の比較的大きなミスマッチ (ループ状/バブル状の構造) を認識することが分かった。一方, MutS2 は, 同じく DNA/DNA または DNA/RNA 2 本鎖分子に結合するが, BsbP とよりもさらに大きな 10 塩基以上のループ状/バブル状構造を認識することが分かった。そのようなミスマッチ構造は, RNA を検出するための逆転写反応において, primer と鋳型の間で形成されると予想される構造である。そこで, MutS2 や BsbP が, ミスマッチを含む primer-DNA または primer-RNA 複合体からの DNA 増幅を阻害するかどうかを, real-time PCR 装置を用いて調べた。その結果, 両タンパク質は, ミスマッチを含む primer-鋳型複合体からの増幅を特異的に阻害した。DNA 結合特異性の解析結果から示唆されたとおり, BsbP や MutS2 は, primer-鋳型複合体が比較的大きなミスマッチ (3 塩基以上) を含む場合に, 核酸の増幅を強く阻害した。これらの特徴は, primer の設計を工夫することによって, 目的の配列を持った DNA または RNA を特異的に検出する方法に応用可能であると考えられる。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Biochemical characterization of mismatch-binding protein MutS1 and nicking endonuclease MutL from a euryarchaeon Methanosaeta thermophila.2019

    • 著者名/発表者名
      Ai Minobe, Kenji Fukui, Hitomi Yonezu, Koki Ohshita, Saki Mizobuchi, Takashi Morisawa, Yuichi Hakumai, Takato Yano, Makoto Ashiuchi, Taisuke Wakamatsu
    • 雑誌名

      DNA Repair

      巻: 75 ページ: 29-38

    • DOI

      10.1016/j.dnarep.2019.01.005.

    • 査読あり
  • [学会発表] Methanosaeta thermophila 由来ミスマッチ結合タンパク質 MutS1 及びニッキングヌクレアーゼ MutL 生化学的機能解析2018

    • 著者名/発表者名
      美濃部 亜衣、福井 健二、米津 ひとみ、大下 紘貴、溝渕 早紀、森澤 高至、白米 優一、矢野 貴人、芦内 誠、若松 泰介
    • 学会等名
      第19回 極限環境生物学会 年会

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公開日: 2019-12-27  

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