| 研究課題/領域番号 |
16K18779
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
鈴木 哲仁 京都大学, 農学研究科, 助教 (00723115)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 細菌検査 / 可に検出 / 多孔質高分子 / 金属メッシュセンサ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細菌検査の前処理用のツールとして、高性能な分離・反応担体として知られるモノリス型ポリマーを用い、細菌の簡易抽出カラムの製作を目指す。前年度までに、モノリス型ポリマー充填カラムの作製ならびに内部の化学修飾により目的の細菌を特異的に捕捉する機能の付与を行うプロトコルの検証を行ってきた。平成30年度は、異なる菌濃度での大腸菌抽出能と夾雑物の影響評価を行った。抗体修飾を行ったモノリスに細菌懸濁液0.1mLを流して反応させ、ストリッピング剤で剥離して回収し菌数を定量した。細菌数を10^4から10^6 cellsに調製したところ、回収率（抗体からストリッピング剤により回収した菌数／投入総菌数）はそれぞれ、16.3% から0.2％となり、菌数としては十分に確認できたが、菌数が増えるほど回収率が下がる結果となった。大腸菌を蛍光染色してモノリスの断面を観察したところ、壁面近くに多く残留しており、菌数が多いと洗浄やストリッピングでも除去しきれない菌が残ることが確かめられた。
一方で、検出用のツールとして金属メッシュセンサの高感度化の検討を行った。上記ツールと組み合わせれば、対象の細菌がカラムで選択的に抽出されるため、通り抜けてくる菌体をそのまま検出すればよい。しかし、金属メッシュの構造スケールに対して細菌のサイズが小さく、センサの感度の良い場所に被測定物を配置する必要があった。そこで、金属メッシュの開口部分に多孔質モノリス型ポリマーを固相化することで、電界が局在してセンサとして感度の高い部位に被測定物を固定することを試みた。ビオチン―ストレプトアビジン結合の検出を行ったところ、金属表面に被測定物を直接固定する場合と比べて8.5倍の感度向上が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度までから、細菌を再回収する際にポリマーが壊れやすいことが判明し、耐久性の高いポリマー素材の検討が課題であった。本年度、プロトコルの改良によって強度の確保もできたうえで、大腸菌抽出能評価を行った。次年度は、本研究課題の最終目標として、実際の食品中の細菌抽出能の評価を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで別個で検討してきた金属メッシュセンサと簡易抽出カラムを組み合わせ、実際に細菌の菌種判定ならびに定量の可能性を明らかにすることを目指す。特に最終目標として、牛乳をモデル試料として用い、夾雑物混在下での抽出性能を評価したうえで、センサを用いた検出可能性を評価する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年までの研究成果から、抽出カラム中に充填するモノリスポリマーに薬品耐性の問題があることが判明したため、ポリマー担体の素材やバッファーの種類を検討し直す必要が生じ、検証のために想定以上の時間を要した。また、検出用センサである金属メッシュの構造決定のために電磁界解析を行うPCが故障し、修理した。故障からソフトの再導入までの間、センサの種類が決められず実験の遅延が生じた。以上の理由により、実際の食品試料を用いた細菌抽出ならびに検出の実験を次年度に行う。また、ポリマーモノリスカラムにより特異的に抽出した細菌を検出するため、フィルタそのものの光学測定から簡便に検出する手法についても検証する。
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