| 研究課題/領域番号 |
16K18812
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
山中 大介 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (10553266)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | エンドサイトーシス / サイログロブリン / 甲状腺ホルモン / アクチン結合タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
甲状腺ホルモンは、動物の正常な発達・成長・成熟や基礎代謝の維持に必須なホルモンで、甲状腺刺激ホルモン（TSH）とインスリン様成長因子（IGF）が、甲状腺機能の制御、ひいては甲状腺ホルモンの血中濃度の調節に重要な役割を果たしていることが知られている。最近申請者らは、TSHとIGFによる甲状腺細胞の相乗的増殖誘導を司る新規クロストーク制御タンパク質としてPI3KAPを同定したが、PI3KAPをノックアウトしたマウスの解析から、PI3KAPが甲状腺ホルモン産生を調節している可能性が明らかとなった。そこで本研究では、PI3KAPによる甲状腺ホルモン産生の新しい調節機構を解明することを目的としている。
甲状腺ホルモン産生に必須なステップのひとつとして、ホルモン前駆体であるサイログロブリンが甲状腺濾胞細胞に再吸収（エンドサイトーシス）されるステップを挙げることができる。ノックアウトマウスを用いた解析などにより、PI3KAPがこのステップに関与することが示唆されたことから、PI3KAPのエンドサイトーシス経路における役割と、その分子機構の解析を進めている。PI3KAPを甲状腺培養細胞株において機能阻害（ノックダウン）し、蛍光色素の取り込み量を指標にエンドサイトーシス経路の活性化を調べたところ、エンドサイトーシス経路の阻害が観察された。またPI3KAPが細胞骨格（アクチン骨格）と結合するアミノ酸配列を特定し、この領域がエンドサイトーシス経路の活性化に必要であることもわかった。さらに、甲状腺細胞においてサイログロブリンの取り込み量を測定できる実験系を確立した。
今後、ノックアウトマウス由来の甲状腺初代培養細胞を用いた解析や、PI3KAP結合タンパク質の同定などを行い、分子機構をさらに詳細に明らかにする予定である。最終的には遺伝子改変マウスなどを用いてこの機構が甲状腺ホルモン産生に重要であることを示すことを目標としている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、PI3KAPを介したエンドサイトーシス経路の活性調節に着目し、甲状腺ホルモン産生の新しい調節機構を解明することを目的としている。甲状腺培養細胞株においてPI3KAPをノックダウンし、蛍光色素（FITCデキストラン）の取り込み量が低下したことは、PI3KAPがエンドサイトーシス経路の活性化に必須であることを示している。また遺伝子導入が容易な293細胞にPI3KAPを過剰発現するとFITCデキストラン取り込みが増加する一方で、アクチン骨格への結合配列を欠くPI3KAPではこのような効果が見られないことから、この現象の分子機構にはアクチン骨格との結合が重要であることを示した。さらに、甲状腺培養細胞株においてFITC標識したサイログロブリンを利用して、TSHに応答したサイログロブリンの取り込みの増加を観察できる実験系を確立した。このようにPI3KAPのエンドサイトーシス経路における重要性とその分子機構の一端を示すことができたと同時に、新しい甲状腺ホルモン産生機構を解明するための実験系も整いつつある。しかし、質の良い甲状腺初代培養細胞をノックアウトマウスから作製する作業が難航し、PI3KAPによるエンドサイトーシス制御と甲状腺ホルモン産生の関連について十分な証拠が得られていないという課題も残されている状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き初代培養甲状腺細胞の調製法について条件検討を重ねて方法を確立し、ノックアウトマウスの甲状腺細胞を用いて解析を進める。ノックアウト甲状腺細胞と野生型細胞において、サイログロブリンの取り込み量を比較しPI3KAPノックアウトの影響を調べる。また甲状腺培養細胞株や初代培養甲状腺細胞においてPI3KAPを過剰発現させてサイログロブリン取り込みを調べることにより、このタンパク質のどのドメイン構造が重要であるか明らかにしていく。並行して、当初の計画通り、PI3KAP結合タンパク質の同定・機能解析を進めるとともに、明らかにした分子機構の重要性をin vivoで示すために遺伝子改変マウスの作製に着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学会発表するために必要な結果が十分にそろっていないと判断し、学会発表を次年度に見送ったため旅費を使わなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
主に研究遂行に必要な試薬類の購入や学会発表のための旅費に使用する。
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