| 研究課題/領域番号 |
16K18817
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
吉川 泰永 北里大学, 獣医学部, 講師 (00552043)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | BRCA2 / 転写抑制 / サイレンサー / シス因子 / トランス因子 / 転写抑制因子 |
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| 研究実績の概要 |
イヌ乳腺腫瘍発症の抑制遺伝子産物であるBRCA2は相同組換え修復に貢献することで細胞の腫瘍化を防いでいる。近年、BRCA2の発現 量の低下が腫瘍発症と関係することが報告され始めている。申請者はイヌBRCA2のイントロンに新規サイレンサー配列が存在することを見出した。平成２８年度までに、イントロンの一部（50 bp）に転写を抑制する活性があることを証明し、そのDNA配列に相互作用するタンパク質を質量分析により数種類同定した 。平成２９年度においては、２８年度に得られた結果をさらに詳しく研究した。
サイレンサー配列が存在する領域を50 bpの長さで限定したので、10 bp単位で変異を導入し、どの塩基配列が特に重要なのかルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより検討した。変異を導入後に転写の抑制が解除される領域が少なくとも二カ所存在した。サイレンサー配列と相互作用する可能性があるタンパク質が特異的にサイレンサー配列と相互作用するのか調べるために、２８年度と同様にビーズを用いた生化学的な精製法を行い、それらのタンパク質が検出されるかウエスタンブロットにより確認した。その結果、少なくとも3種類のタンパク質は、特異的な相互作用が観察された。これらのタンパク質を強制発現またはノックダウンした細胞を作製した。現在、この細胞を用いて、現在BRCA2の発現量の変化やChIPアッセイにより、細胞内において実際にサイレンサー配列に相互作用しているのか検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
転写抑制に関わるタンパク質を順調にスクリーニングすることが出来ているが、実験計画を立てた時点では、実験項目に無かった実験手法により、より詳しく機能解析を行う必要が出てきたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
ChIPアッセイの実験手法の確立に時間を要していたが、概ね実験手法は確立できたので、平成30年度は順調に実験することが出来ると考えられる。
今年度は、細胞周期を同調した実験手法により、BRCA2の発現解析を行うことと平行して、各種腫瘍細胞株や腫瘍サンプルにおける発現量解析を実施する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
効率的な試薬等の購入が行えたため、少額の差額が発生した。
平成３０年度においても試薬等の購入が必要なので、併せて使用する予定である。
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