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2016 年度 実施状況報告書

軸索内ミトコンドリアの恒常性維持機構とその役割

研究課題

研究課題/領域番号 16K18977
研究機関生理学研究所

研究代表者

大野 伸彦  生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 特任准教授 (10432155)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード有髄軸索 / ミトコンドリア / 小胞体 / 脱髄 / ライブイメージング
研究実績の概要

ラット脊髄神経節培養を調整し、神経細胞にミトコンドリア標的蛍光蛋白Dendra2(mitoDendra2)をレンチウイルスベクターを用いて導入した。有髄および無髄軸索において紫外線照射で色変換(緑色→赤色)後、共焦点レーザー顕微鏡下で長期(10時間以上)のライブイメージングを行い、静止ミトコンドリア内の赤色蛍光蛋白と外部から輸送される緑色蛍光蛋白のターンオーバーを観察した。その結果、多くのミトコンドリアが軸索内において非常に安定な状態で長時間静止していること、さらにより大きな静止ミトコンドリアは長時間静止することがわかった。また、変換後に色の戻る速度(ターンオーバー)と相関する因子の同定を試みたところ、軸索におけるミトコンドリアの輸送速度と輸送されるミトコンドリアの数が有意に相関することが分かった。
次にミトコンドリア標識および小胞体標識蛍光蛋白を培養神経細胞に導入し、有髄および無髄軸索において共焦点レーザー顕微鏡下で長期(10時間以上)のタイムラプスイメージングを行い、静止および輸送ミトコンドリアと小胞体の動態および光学顕微鏡レベルの共分布の時間的変化を検討した。その結果、ミトコンドリアと小胞体の分布は相関関係を示し、静止ミトコンドリアが長時間滞在している軸索部分の小胞体の蛍光強度が高い傾向がみられた。
また、マウスの尾神経を用いて、ミトコンドリアと小胞体の変化をミクロトーム組み込み式走査型電子顕微鏡を用いて解析を開始した。その結果、ミトコンドリアと小胞体の分布に相関関係がみられ、また豊富なミトコンドリアと小胞体の接触部(mitochondria associated membranes)がみられることがわかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ラット脊髄神経節培養とミトコンドリア標識および小胞体標識蛍光蛋白によるライブイメージングの研究が順調に進んでいる。またミクロトーム組み込み式走査型電子顕微鏡による解析においてもデータの取得を開始できており、おおむね順調に進んでいると考えられる。

今後の研究の推進方策

神経細胞に分裂融合関連分子や輸送関連分子、分解関連蛋白の正常型および変異型を導入し、ターンオーバーの変化を観察することで、ターンオーバーに影響を及ぼす因子の同定と修飾の影響の解析を進める。またAMPKの修飾に伴うターンオーバーの変化の観察も進める。ミトコンドリア機能(膜電位)を比較するため、これらの処理下で膜電位感受性色素を用いたミトコンドリアの機能評価も行う。
さらに、正常マウスの中枢・末梢神経組織を用いて、電子顕微鏡用試料を作製し、Serial Block Face- Scanning Electron Microscopy(SBF-SEM)を用いて連続電子顕微鏡画像を取得後、超微形態の3次元再構築を行い、ミトコンドリアと小胞体の相互作用の詳細な立体的分布および表面積を解析する。またミトコンドリアと小胞体の結合に関わる分子(Mfn2、VDAC1、IP3R)に対して包埋前免疫染色後にSBF-SEM観察し、ミトコンドリアと小胞体の相互作用における結合関連分子の分布を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

異動に伴って、既に施設で保有されていた消耗品を使用することができたため、予定以上に積極的な成果発表に伴う費用の増大があったものの、当初の予定よりも大幅に物品費を削減し、研究計画を遂行することができた。

次年度使用額の使用計画

今後、さらにデータの取得を進めるとともに引き続き積極的な成果発表を行う予定であり、これらの費用として使用する予定である。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 4件)

  • [国際共同研究] クリーブランドクリニック(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      クリーブランドクリニック
  • [雑誌論文] GlcNAc6ST-1 regulates sulfation of N-glycans and myelination in the peripheral nervous system2017

    • 著者名/発表者名
      Yoshimura T, Hayashi A, Handa-Narumi M, Yagi H, Ohno N, Koike T, Yamaguchi Y, Uchimura K, Kadomatsu K, Sedzik J, Kitamura K, Kato K, Trapp BD, Baba H, Ikenaka K.
    • 雑誌名

      Sci Rep.

      巻: 7 ページ: 42257

    • DOI

      10.1038/srep42257.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Proteolipid protein-deficient myelin promotes axonal mitochondrial dysfunction via altered metabolic coupling.2016

    • 著者名/発表者名
      Yin X, Kidd GJ, Ohno N, Perkins GA, Ellisman MH, Bastian C, Brunet S, Baltan S, Trapp BD.
    • 雑誌名

      J Cell Biol.

      巻: 215 ページ: 531-542

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] Successful applications and pitfalls in three dimensional ultrastructural analyses of biological specimens with SEM2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第59回シンポジウム
    • 発表場所
      帝京平成大学池袋キャンパス(東京都豊島区)
    • 年月日
      2016-11-19
    • 招待講演
  • [学会発表] オルガネラ動態の生理機能に迫る最先端3次元微細構造解析法2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      第63回中部日本生理学会
    • 発表場所
      岡崎コンファレンスセンター(愛知県岡崎市)
    • 年月日
      2016-11-04
    • 招待講演
  • [学会発表] 髄鞘による軸索のオルガネラ動態制御とその破綻2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      第59回神経化学会大会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-09-08
  • [学会発表] 有髄神経におけるミトコンドリア恒常性の維持機構2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      第2回日本ミエリン研究会
    • 発表場所
      横浜ランドマークセンター(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-07-23
  • [学会発表] Polarization of energy metabolism and mitochondrial behavior in myelinated axons2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      第39回日本神経科学大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2016-07-20
  • [学会発表] 有髄軸索におけるミトコンドリア恒常性2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      ミトコンドリアサイエンスワークショップ2016
    • 発表場所
      福岡リーセントホテル(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-07-13
    • 招待講演
  • [学会発表] 生物組織のSEM連続断面観察法に資する樹脂の開発2016

    • 著者名/発表者名
      大野伸彦
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第72回学術講演会
    • 発表場所
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2016-06-14
    • 招待講演

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公開日: 2018-01-16   更新日: 2022-02-16  

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