| 研究課題/領域番号 |
16K18982
|
|---|
| 研究機関 | 帝京大学 |
|---|
研究代表者 |
中倉 敬 帝京大学, 医学部, 助教 (60568658)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 微小管 / αチューブリン / アセチル化修飾 / ACTH細胞 / 下垂体 / グルココルチコイド受容体 / 翻訳後修飾 / 核移行 |
|---|
| 研究実績の概要 |
内分泌細胞が機能するためには、ホルモンを含む分泌顆粒や受容体などを必要な場所へ送り届けるシステムが正確に働く必要がある。細胞内部における物質輸送は、細胞質に張り巡らされた微小管により調節される。微小管はαとβチューブリンにより構成されるストロー状の構造であり、チューブリンは細胞種ごとに様々な翻訳後修飾を受け、その機能を調節している。申請者の過去の研究結果から、副腎除去ラット下垂体の副腎皮質刺激ホルモン (ACTH) 細胞でαチューブリンのアセチル化とその特異的アセチル化酵素ATAT1の発現が増加することを見出し、論文として報告しているが、一方でその生物学的意義は未だ不明なため、これまでマウスACTH細胞株AtT20を用いた分子細胞生物学的解析に取り組んでいる。
本年度は、ACTH細胞におけるαチューブリンアセチル化修飾のグルココルチコイド受容体（GR）核移行への影響を明らかにするため、siRNAによってATAT1をノックダウンしたAtT20に対してデキサメサゾン（Dex）による刺激を行った際の核内GR量の変動をウエスタンブロット法により解析した。その結果、ATAT1発現をノックダウンすることで、核内GR量が低下することが明らかとなった。また、ACTH前駆体POMCの遺伝子発現の変化をリアルタイムPCRにより調べた結果、コントロール群ではDex刺激によりPOMC発現が抑制されたが、ATAT1ノックダウン群では変化しなかったことから、αチューブリンアセチル化修飾の抑制によりGR核移行の割合が低下したと考えられた。加えて、ATAT1遺伝子の過剰発現実験を試みた結果、Dex刺激後の核内GR量が上昇することが明らかとなったため、ここまでの成果を論文としてまとめ、発表した (Nakakura et al. Cell Tissue Res., 2017)。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、チューブリンアセチル化酵素ATAT1の発現増減を利用した細胞生物学的実験により、ACTH細胞ではαチューブリンのアセチル化修飾がGRの核移行を調節していることを見出し、論文として発表するに至った。一方で、GRがどのようなメカニズムでアセチル化修飾を認識するのかは明らかにできていないため、次の段階としてGR複合体によるアセチル化αチューブリン（微小管）の認識機構について解析を進める必要がある。ただ、本年度後半は所属機関の教育業務に忙殺され、本格的な解析を行うまでには至っていない。そのため次年度に本実験計画を遂行する予定である。もともと本研究計画は次年度への繰り越すことも想定していたので、研究自体の大きな遅れとはならない。本年度はチューブリンアセチル化のACTH細胞における作用点を見つけ、論文として発表することができたこともあり、研究計画としては概ね順調に進んでいると考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
GR複合体によるαチューブリンアセチル化修飾の認識機構を明らかにするため、まずαチューブリンのアセチル化修飾部位に対する変異体および野生型プラスミドをそれぞれAtT20細胞に過剰発現させ、その破砕液を用いて抗αチューブリン抗体や抗βチューブリン抗体による共免疫沈降法を行う。得られた沈降サンプルをSDS-PAGEにかけ、野生型で特異的に見られるバンドを切り出し、LC-MS/MSなどによって結合物質を特定する。さらに、特定した物質をFLAG タグ融合タンパク質としてAtT20 細胞に強制発現させ、タグを指標に共免疫沈降法を行い、ウエスタンブロット法でアセチル化αチューブリンやGRの共沈を調べることで、アセチル化認識因子の同定を進める。以上の解析から、チューブリンアセチル化修飾とGR核輸送をつなぐ分子メカニズムの全貌を明らかにする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
繰越金が生じた理由として、もともとLC-MS/MSによる受託解析を本年度に計画していたが、年度後半に予定していた実験が実習などの教育業務で忙殺され、研究の開始を次年度に遅らさざるを得なかったことが挙げられる。このため、繰越金は次年度の消耗品費とその他経費に加えることで、適切に使用する。
次年度の研究費82万円のうち消耗品に42万円、旅費に10万円、その他に30万円を計画している。消耗品の内訳としては、細胞培養関連試薬（培養液、抗生物質、培養シャーレ他）、タンパク質実験試薬（抗体他）、プラスチック器具（メスピペット、チップ、チューブ類）の購入を計画している。旅費は、成果を発表する目的で学術集会に参加するための交通費および宿泊費にあてる。その他経費は受託解析費と学会参加費に使用する。
|
