| 研究実績の概要 |
研究代表者は既に、従来の免疫組織化学染色法（蛍光二重染色法）を用い、マウス門脈平滑筋細胞においてSUR2Bタンパク質およびKIR6.1タンパク質が共発現していることを明らかにしている（Yamamoto et al., Vascul. Pharmacol., 2015）。しかし、両サブユニットタンパク質が互いに近接し、カップリング（共役）しているか、否かについては未だ不明のままであった。そこで、細胞・組織における微量な内在性タンパク質の相互関係を画期的な増感技術で特異的に検出、可視化することが可能な『Proximity ligation assay（PLA）法』を駆使し、マウス門脈平滑筋細胞における血管平滑筋型KATPチャネルの分子サブユニット構造を決定することを研究目的として、以下の研究を実施した。
初年度は、現有する両一次抗体（ヤギ由来抗SUR2B抗体、ウサギ由来抗KIR6.1抗体）を用いて『PLA法』を実施し、SUR2B、KIR6.1タンパク質のカップリングを示すPLAシグナルの蛍光スポットが観察された。
本年度は、これら両サブユニットタンパク質のカップリングの有無の確証実験として、（１）両一次抗体に対する抗原ペプチドを用いた抗体吸収試験を行い、吸収処理を終えた一次抗体を用いて『PLA法』を実施した。また（2）HEK293細胞にKATPチャネルサブユニット（SUR2BおよびKIR6.1）のcDNAを強制発現させた実験系を構築し、遺伝子導入していない細胞サンプルをnegative controlとして同様の実験を実施した。さらに（3）マウス門脈平滑筋細胞にSUR2B遺伝子およびKIR6.1遺伝子を選択的に抑制するsiRNAを導入する実験系の構築にも取り組んでおり、同様の実験を予定している。これらの実験結果は、初年度に得られた成果を概ね裏付けるものであった。
|
