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2017 年度 実施状況報告書

ミトコンドリア呼吸制御機構の解析と神経変性疾患におけるその破綻

研究課題

研究課題/領域番号 16K19037
研究機関岡山大学

研究代表者

村田 等  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (90579096)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードSARM1 / ミトコンドリア / リン酸化
研究実績の概要

ミトコンドリア呼吸制御に関わるSARM1のリン酸化の意義について解析を行った。前年度までにSARM1が細胞死を誘導する条件でリン酸化をうけることを見出し、そのリン酸化部位やリン酸化酵素の同定を行った。今年度はこのリン酸化によってSARM1のNAD分解活性が制御されていることを見出した。SARM1の活性化でNAD量が減少し、その結果ミトコンドリアのATP合成量が低下していた。内在性のSARM1のリン酸化を検出するためにSARM1のリン酸化抗体を作製し、解析を行った。SARM1のリン酸化は酸化ストレス環境下で亢進し、SARM1の発現抑制やリン酸化酵素の抑制でSARM1のリン酸化や細胞死は減少した。興味深いことにパーキンソン病患者由来のiPS細胞から分化誘導した神経細胞では健常者由来の神経細胞と比較して有意にSARM1のリン酸化レベルの上昇がみられた。これらの結果をまとめ、現在論文を投稿中である。
SARM1の結合タンパク質としてミトコンドリア呼吸鎖複合体のタンパク質を見出している。このタンパク質を強制発現するとSARM1の強制発現によって誘導される細胞死が緩和されたことから、SARM1がこのタンパク質との結合を介して細胞死誘導に関与している可能性がある。これまでに複数のSARM1変異体を作製しているので、これらの変異体との結合解析等からSARM1の呼吸制御機構について更に検討を進めていく。
SARM1を介した呼吸制御が神経細胞に及ぼす影響を解析するために、CRISPR-Cas9システムを用いてSARM1ノックアウト細胞の樹立を行っている。現在はSARM1の標的配列がCas9で切断されていることを確認し、シングルセルクローニング法で細胞を増殖させている段階である。シークエンス及びウェスタンブロッティング等でSARM1の発現がなくなっていることを確認し、その後の解析に用いていく。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

SARM1のリン酸化制御について概ねその制御メカニズムを解明することができ、論文投稿に至った。SARM1の呼吸制御につながる重要なタンパク質を見出しているので、更に検討を進めていくことができる。来年度に計画している健常者及びパーキンソン病患者由来の神経細胞を用いた呼吸制御解析のためにCRISPR-Cas9の系を用いてSARM1ノックアウト細胞の樹立を行っている。SARM1の標的配列がCas9で切断されていることを確認しており、シングルセルクローニング法で細胞を増殖させている段階であるので、細胞を樹立後、解析を進めていく。

今後の研究の推進方策

SARM1の結合タンパク質として見出している呼吸鎖複合体タンパク質の解析を重点的に解析していく。これまでに細胞死誘導活性の低いSARM1変異体等を複数作製しているので、ミトコンドリアを単離し、結合実験や呼吸活性の違いなどの比較から解析を進めていく。
現在樹立を目指しているSARM1ノックアウト細胞を用いて神経細胞の成熟過程にミトコンドリア呼吸制御が及ぼす影響について解析を進めていく。またパーキンソン病患者由来の神経細胞で明らかに細胞死が亢進していることを見出しているので、この細胞死にSARM1が及ぼす影響についても解析を行う。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2017

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Signal Diversity of Receptor for Advanced Glycation End Products.2017

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi M, Kinoshita R, Putranto EW, Ruma IMW, Sumardika IW, Youyi C, Tomonobu N, Yamamoto KI, Murata H.
    • 雑誌名

      Acta Med Okayama

      巻: 71(6) ページ: 459-465

    • DOI

      doi: 10.18926/AMO/55582.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Robust cancer-specific gene expression by a novel cassette with hTERT and CMV promoter elements2017

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi Masakiyo、Sadahira Takuya、Ueki Hideo、Kinoshita Rie、Murata Hitoshi、Yamamoto Ken-Ichi、Futami Junichiro、Nasu Yasutomo、Ochiai Kazuhiko、Kumon Hiromi、Huh Nam-Ho、Watanabe Masami
    • 雑誌名

      Oncology Reports

      巻: 38 ページ: 1108~1114

    • DOI

      doi: 10.3892/or.2017.5710

    • 査読あり
  • [雑誌論文] b-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein b-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase 3 Increases MCAM Stability, Which Enhances S100A8/A9-Mediated Cancer Motility.2017

    • 著者名/発表者名
      Sumardika I Wayan、Youyi Chen、Kondo Eisaku、Inoue Yusuke、Ruma I Made Winarsa、Murata Hitoshi、Kinoshita Rie、Yamamoto Ken-Ichi、Tomida Shuta、Shien Kazuhiko、Satoh Hiroki、Yamauchi Akira、Futami Junichiro、Putranto Endy Widya、Hibino Toshihiko、Toyooka Shinichi、Nishibori Masahiro、Sakaguchi Masakiyo
    • 雑誌名

      Oncology Reserch

      巻: in press ページ: in press

    • DOI

      doi: 10.3727/096504017X15031557924123

    • 査読あり
  • [学会発表] ミトコンドリア呼吸鎖複合体への作用を介したSARM1の神経細胞死誘導2017

    • 著者名/発表者名
      村田等、西川茜、高松仁志、山本健一、木下理恵、阪口政清
    • 学会等名
      第90回日本組織培養学会大会
  • [学会発表] 健常者及びパーキンソン病患者iPS細胞由来の神経細胞を用いたミトコンドリア機能解析2017

    • 著者名/発表者名
      村田等、山本健一、木下理恵、阪口政清
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会

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公開日: 2018-12-17  

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