| 研究課題/領域番号 |
16K19066
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
玉田 紘太 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (10550957)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 15q11-q13 / Prader-Willi syndrome / Genome Imprinting / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムインプリンティングは両親の片方の親から受け継いだ遺伝子のみが発現する遺伝子発現制御である。ヒト染色体１５ｑ１１－ｑ１３(PWS/AS領域)では５つの父性由来染色体発現遺伝子と１つの母性由来染色体発現遺伝子が存在し、全てインプリンティングセンターによる制御を受けている。本研究ではPWS/AS領域中のインプリンティングを受けるSnrpn遺伝子の発現を蛍光タンパクをもって生細胞にて可視化し、インプリンティング確立に必要な因子、そのメカニズム、また不活性化アリルの再活性化因子を同定することを目的とする。
目的達成のためにはSnrpn-EGFPおよび、Snrpn-mCherryノックインマウスが必要となることから、CRISPR/Cas9を用いて受精卵へ直接遺伝子導入を行い、ノックインマウスの作製を試みた。
昨年度は本マウス作製のために、CRISPR/Cas9の従来法から改良の加えられたPITCh法、およびsingle strand donorを用いたノックイン動物の作製を試みた。様々な条件でのインジェクションを行ったが、ランダムインテグレーションのマウスが数匹、NHEJが発生したマウスのみが採れ、正確にノックインされたマウスは作製できなかった。現在はelectroporationを用いたGONADによるノックイン動物の作製を試みており、実験系の迅速化を図っている。コントロール実験としてGONAD法によるノックアウトマウスについては作製できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
想定以上に正確なKI動物が採れず難航している。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、これまでの使用されてきた受精卵インジェクション法ではなく、electroporationを用いた方法にてKI動物の作製を試みている。これまでに比べて迅速かつ大量に処理ができることが期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CRISPR/Cas9によるKI動物の作製が当初の予定に比べて遅延している。本研究期間内に高効率な方法が報告され、これを検討しているため延長が必要となる。また研究代表者の本研究以外の業務が予定を超える量となったため、これも延長の理由となっている。延長した期間内には、上記KI動物作製のための試薬購入費として使用する。
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