B型肝炎ウイルスの感染許容能に関わる宿主因子の同定と機能解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K19145
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 九十田 千子 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 特別研究員 (20710263)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: ウイルス / HBV / NTCP

研究実績の概要

これまでにB型肝炎ウイルス（HBV）感染許容性/非許容性細胞を用いてトランスクリプトーム解析し、HBV感染許容性HepG2-hNTCP-C4細胞で発現の高い23因子を同定した。siRNAを用いたHBV感染実験から、これらのうち４因子がHBV感染感受性を低下させることを見出している。今回はこれらのうち２因について、１) HBV生活環のどのステップを阻害するのか、２）HBV感染受容体NTCPの局在や発現量に影響を与えるかに関して主に解析した。１）HBV生活環の吸着過程を評価するため、HBVエンベロープタンパク質の一部を蛍光標識したペプチドを用いて検討した。また、侵入以降から核輸送過程について、D型肝炎ウイルス（HDV）を用いて検討した。１つの因子についてsiRNAを用いての内在性発現を低下することでHBVの吸着、HDV感染の低下が観察されたことから、この因子はHBV生活環の吸着過程に関与することが示唆された。もう一方の因子の内在性発現を低下することでHDV感染は低下するがHBVの吸着低下は観察されなかったことから、この因子はHBV生活環の侵入以降から核輸送過程に関与することが示唆された。２）前者の因子の内在性発現を低下することで細胞膜に局在するNTCP、NTCPタンパク質発現量の低下が観察された。NTCP mRNA量には影響しないことが示唆されたため、この因子はNTCPタンパク質分解制御に関与することが示唆された。また、後者の因子の内在性発現を低下することでNTCPタンパク質発現量、NTCP mRNA量の低下は観察されなかったが、細胞膜に局在するNTCPの増加、およびウェスタンブロットにおけるNTCPの移動度の変化が観察されたことから、この因子はNTCP局在および翻訳後修飾に関与することが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今回の結果よりHBV感染許容性を規定する４因子を同定した。これまでHBVの感染許容性を規定する宿主因子およびHBVのNTCP吸着後のイベントを制御するメカニズムに関しては多くが明らかになっていない。またNTCPの局在・翻訳後修飾を制御する因子やメカニズムについてもほとんど明らかになっていないが、今回の結果より２因子がNTCPの局在・翻訳後修飾、タンパク質分解制御に関与する因子であることが示唆された。これらのメカニズムを解明するために有用な知見である。本研究結果に関する論文作成に必要な結果は近々全て得られると期待できる。
また、HBVの侵入から核輸送過程を標的としHBV感染を阻害するcilnidipineは、HBVの膜と細胞の膜成分との融合には影響しないという結果を得ており、侵入過程を標的とする新しいメカニズムを有するHBV侵入阻害剤であることが示唆された。本研究結果に関する論文作成に必要な結果も近々全て得られると期待できる。従って本研究は当初の予定通りに進行している。

今後の研究の推進方策

今年度の研究結果より、２つの因子が制御するHBV生活環のステップ、およびNTCP局在・翻訳後修飾に関与すること示されが、NTCP局在・翻訳後修飾のメカニズムについてはまだ詳細な解析が必要である。次年度は、同定した２因子によるNTCPの局在・翻訳後修飾制御が、直接NTCPに結合することにより制御するのか、NTCPに特異的であるかあるいはその他のトランスポータータンパク質の制御にも関わるのかを含め、詳細な制御メカニズム解析する。これに加え、HBV感染許容性を規定すると示唆される他の２因子に関しても、同様に制御メカニズムを解析する。また、これらの因子がマウス肝細胞のHBV感染許容性に寄与するかも解析する。
さらに、cilnidipineがHBV侵入過程を標的とするメカニズムをHBVエンベロープタンパク質の一部を蛍光標識したペプチドを用いた観察およびウイルス学的解析を用いて解析するとともに、cilnidipineの標的分子の同定を進める予定である。

次年度使用額が生じた理由

ファージディスプレイ法を用いてcilnidipineの標的を探索するよて一だったが、先にウイルス学的解析を進め、次年度に必要な試薬を購入することにしたため。また、予定していた国際学会の参加に使用しなかったため。

次年度使用額の使用計画

今年度に使用しなかった研究費は、次年度に予定を変更した研究および次年度計画の研究に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Cyclosporin derivatives inhibit hepatitis B virus entry without interfering with NTCP transporter activity. (2017)
  • 著者名/発表者名: 1)Shimura S, Watashi K, Fukano K, Peel M, Sluder A, Kawai F, Iwamoto M, Tsukuda S, Takeuchi JS, Miyake T, Sugiyama M, Ogasawara Y, Park SY, Tanaka Y, Kusuhara H, Mizokami M, Sureau C, Wakita T
  • 雑誌名: Journal of Hepatology 巻: 66 ページ: 685-692
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2016.11.009
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins (2017)
  • 著者名/発表者名: 2)Tsukuda S, Watashi K, Hojima T, Isogawa M, Iwamoto M, Omagari K, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Sureau C, Wakita T
  • 雑誌名: Hepatology 巻: 65 ページ: 1104-1116
  • DOI: 10.1002/hep.28952
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Fungal-derived neoechinulin B as a novel antagonist of liver X receptor, identified by chemical genetics using hepatitis C virus cell culture system (2016)
  • 著者名/発表者名: 3)Nakajima S, Watashi K, Ohashi H, Kamisuki S, Izaguirre-Carbonell J, Tae-Jun Kwon A, Suzuki H, Kataoka M, Tsukuda S, Okada M, Moi ML, Takeuchi T, Arita M, Suzuki R, Aizaki H, Kato T, Suzuki T, Hasegawa H, Takasaki T, Sugawara F, Wakita T
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 90 ページ: 9058-9074
  • DOI: 10.1128/JVI.00856-16
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Characterization of origomeric flavonoids as a novel class of anti-HBV entry inhibitors that directly target viral envelope protein. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Hojima T, Isogawa M, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T
  • 学会等名: 第64回日本ウイルス学術集会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター
  • 年月日: 2016-10-23 – 2016-10-25
• [学会発表] Retinoid inhibitors abolish the host permissiveness to hepatitis B virus infection by modulating the expression of NTCP (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T
  • 学会等名: 23rd International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center
  • 年月日: 2016-10-11 – 2016-10-15
  • 国際学会
• [学会発表] Proanthocyanidin and its analogs are new class of HBV and HDV entry inhibitors that target the viral preS1 region (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Hojima T, Isogawa M, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T
  • 学会等名: International meeting on molecular biology of hepatitis B viruses
  • 発表場所: Yonsei University
  • 年月日: 2016-09-21 – 2016-09-24
  • 国際学会
• [学会発表] B型肝炎ウイルスを標的とした新規侵入阻害剤の同定と作用機序の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 九十田千子, 小嶋聡一, 脇田隆字
  • 学会等名: 第52回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: ニューホテルオータニ幕張/東京ベイ幕張ホテル
  • 年月日: 2016-05-19 – 2016-05-20
• [学会発表] B型肝炎ウイルス粒子を直接標的とする侵入阻害剤proanthocyanidin (2016)
  • 著者名/発表者名: 九十田千子、渡士幸一、濱田義知、齊藤安貴子、五十川正記、田中義正、鈴木亮介、相崎英樹、小嶋聡一、杉山真也、田中靖人、溝上雅史、脇田隆字.
  • 学会等名: 第26回抗ウイルス療法学会総会
  • 発表場所: 名古屋東急ホテル、名古屋市立大学
  • 年月日: 2016-05-13 – 2016-05-15
• [学会発表] Inhibition of HBV entry process through targeting host and viral molecules (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Hamada Y, Isogawa M, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • 学会等名: 4th Taiwan-Korea-Japan Research Symposium on Hepatitis B Virus
  • 発表場所: Humanities and Social Sciences Building, Taiwan
  • 年月日: 2016-04-09 – 2016-04-10
  • 国際学会
• [図書] Encyclopedia of Signaling Molecules, 2nd Edition (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Iwamoto M, Watashi K
  • 総ページ数: 4700
  • 出版者: Springer Nature