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2018 年度 実施状況報告書

HBV感染における自然免疫系センサー分子の探索

研究課題

研究課題/領域番号 16K19324
研究機関北海道大学

研究代表者

中井 正人  北海道大学, 大学病院, 助教 (40756003)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2020-03-31
キーワードDNAセンサー
研究実績の概要

種々の肝細胞株各種肝細胞株(HepG2,HepG2.2.15.7,HuH1,HuH6.5,HuH7.5,HLE,HLF)およびHEK293などからTotal RNAを抽出し、RT-PCRを行いcDNA合成を行った後、定量PCR法にて各種DNAセンサー分子(DDX41、MAVS、STING、cGUS、DAIなど)の発現を評価した。(特に、DNAセンサー分子としてDDX41分子に着目し、この発現の多寡を定量PCR法にて確認した。)また、各種肝細胞株に対してTransient transfectionを行うためのsiRNAを設計した。
コントロールと比較して、各肝細胞(HepG2,HepG2.2.15.7,HuH1,HuH6.5,HuH7.5,HLE,HLF)においてDDX41の発現は有意に高く、特にHepG2.2.15.7細胞では多い結果であった。
前年度までに、HepG2.2.15.7細胞もしくはHepAD38.7細胞の上清を濃縮、フィルトレーション、23%NACLおよび50%PEG8000を用いた沈殿法にて作成した感染実験用のHBVウイルス濃縮液を用いて、HBV感染許容細胞株であるNTCP-HepG2-C4細胞株へ感染実験を、14日継代し細胞を回収後、HBV-DNAおよびHBV-RNAを定量PCRで測定し、感染性を確認した。最終的にある程度評価可能な感染タイターを得ることができた。
また、恒常的なDNAセンサー分子をノックダウンした細胞株として、DDX41に対するshRNAを含むレンチウイルスを作成した。このレンチウイルスをコントロールのHepG2細胞株、およびNTCP-HepG2-C4細胞株に対して感染させ、恒常的なDDX41ノックダウン細胞株を作成した。これを複数回継代し、安定させた後、下記の感染実験を施行した。
上記のHBVウイルスを用いて感染実験を施行した結果、DDX41を恒常的にノックアウトしたNTCP-C4-HepG2細胞においては、ノックアウトしていないNTCP-C4-HepG2細胞において、HBV-RNAおよびDNAが、HBV感染暴露後に早期、かつ2倍程度高値に増加する結果が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

DDX41以外のセンサー候補分子の恒常的ノックアウト細胞、強制発現細胞の樹立に時間を要しているため

今後の研究の推進方策

本研究では、DNAセンサー分子としてDDX41が、HBVの感染性に関わることがin vitroの結果から考えられる結果を得た。強制発現細胞による実験や、その他HBs抗原量の評価、免疫染色などの実験はまだ中途段階であり、今後はこれらの結果確認を行うことが必要となる。そのほかの分子に関しても、ノックアウト、強制発現細胞の樹立を行い評価を行う予定である。また、その機序に関しては残念ながら現段階では明らかでないが、今後の研究によって明らかにしていく予定である。強制発現細胞の樹立方法の変更なども検討し、実験を推進していく。

次年度使用額が生じた理由

(理由)当初よりも実験進行が遅れているため
(使用計画)実験進行に応じて必要物品の購入を行うとともに、学会にて実験の遂行に必要な情報収集を行う。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件)

  • [雑誌論文] Glecaprevir and Pibrentasvir for Japanese Patients with Human Immunodeficiency Virus and Genotype 3 Hepatitis C Virus Coinfection: A Report of Three Cases2019

    • 著者名/発表者名
      Sho Takuya、Suda Goki、Kimura Megumi、Shimazaki Tomoe、Maehara Osamu、Shigesawa Taku、Suzuki Kazuharu、Nakamura Akihisa、Ohara Masatsugu、Umemura Machiko、Izumi Takaaki、Kawagishi Naoki、Baba Masaru、Nakai Masato、Natsuizaka Mitsuteru、Morikawa Kenichi、Ogawa Koji、Sakamoto Naoya、for the NORTE Study Group
    • 雑誌名

      Internal Medicine

      巻: 58 ページ: 797~802

    • DOI

      10.2169/internalmedicine.1856-18

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Safety and efficacy of elbasvir and grazoprevir in Japanese hemodialysis patients with genotype 1b hepatitis C virus infection2018

    • 著者名/発表者名
      Suda Goki、Nakai Masato、Sho Takuya、Natsuizaka Mitsuteru、Morikawa Kenichi、Ogawa Koji、Sakamoto Naoya et al.
    • 雑誌名

      Journal of Gastroenterology

      巻: 54 ページ: 78~86

    • DOI

      10.1007/s00535-018-1495-6

    • 査読あり
  • [雑誌論文] L-Carnitine Suppresses Loss of Skeletal Muscle Mass in Patients With Liver Cirrhosis2018

    • 著者名/発表者名
      Ohara Masatsugu、Ogawa Koji、Suda Goki、Kimura Megumi、Maehara Osamu、Shimazaki Tomoe、Suzuki Kazuharu、Nakamura Akihisa、Umemura Machiko、Izumi Takaaki、Kawagishi Naoki、Nakai Masato、Sho Takuya、Natsuizaka Mitsuteru、Morikawa Kenichi、Ohnishi Shunsuke、Sakamoto Naoya
    • 雑誌名

      Hepatology Communications

      巻: 2 ページ: 910~922

    • DOI

      10.1002/hep4.1207

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Liver steatosis and dyslipidemia after HCV eradication by direct acting antiviral agents are synergistic risks of atherosclerosis2018

    • 著者名/発表者名
      Kawagishi Naoki、Suda Goki、Nakamura Akinobu、Kimura Megumi、Maehara Osamu、Suzuki Kazuharu、Nakamura Akihisa、Ohara Masatsugu、Izumi Takaaki、Umemura Machiko、Nakai Masato、Sho Takuya、Natsuizaka Mitsuteru、Morikawa Kenichi、Ogawa Koji、Kudo Yusuke、Nishida Mutsumi、Miyoshi Hideaki、Sakamoto Naoya
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 13 ページ: e0209615

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0209615

    • 査読あり / オープンアクセス

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公開日: 2019-12-27  

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