| 研究課題/領域番号 |
16K19453
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
山本 正嗣 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (40542139)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | スフィンゴシン1リン酸 / ALI / ARDS |
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| 研究実績の概要 |
スフィンゴシン1リン酸（S1P）は、シグナル伝達物質としてアレルギー性免疫応答に関与していることことを先行研究から明らかにしてきた。本研究の目的は、上皮間葉系細胞と炎症細胞との相互作用に着目して、好中球性炎症が中心病態である急性肺障害（acute lung injury: ALI）/急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome: ARDS）におけるS1Pの役割について明らかにすることである。本研究により、スフィンゴシンシグナルを介したALI/ARDSの病態解明につながり、S1Pを標的とするALI/ARDSの新規治療法の確立につながると期待される。
肺胞上皮細胞のBEAS-2BとCalu-3をS1Pで刺激することにより、KRT34、CCL20、ZFP57、RNF39、TAGLN、EREG、PPP1R3B、FST、PTGS2、EDN1、SERPINB2、IL1B、GBP1、CTGF等の遺伝子が4倍以上に増加することを明らかにした。また、Calu-3ではS1PR3が高発現していることをqRT-PCRで明らかにした。また、S1P受容体（S1PR）3をsiRNAでノックダウンするとCCL20の発現が低下すること、抗CCL20抗体の投与により、卵白アルブミン誘発性の気管支喘息マウスモデルで表現型の抑制がみられることを明らかにした。さらにS1PR1と3の拮抗剤であるVPC23019を投与すると同様に気管支喘息マウスモデルの表現型の抑制がみられることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成29年度に予定していたS1Pと上皮細胞の相互作用をトランスクリプトーム解析を用いることで網羅的に明らかにすることができ、実験計画の短縮が可能になったが、炎症細胞の単離培養のアッセイ系の確立に時間がかかり、このアッセイ系の開始に至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は好中球の活性化前後でのS1Pの役割に焦点をあて解析を行う。すなわち、セルソーターを用いて好中球とマクロファージを単離培養して、好中球とマクロファージの活性化、好中球の遊走能に与えるS1Pの役割を明らかにしていく。
具体的にはC57BL/6マウスの血液または骨髄からNeutrophilアイソレーションキットを用いて好中球を、CD11b MicroBeadsを用いて単球/マクロファージをautoMACSにより単離・培養して、S1PRの発現をqRT-PCRで確認する。これで得た好中球およびマクロファージをS1Pで刺激して、好中球の活性化マーカーであるCD66およびCD64の発現、マクロファージの活性化マーカーであるCD11c、CD40、MHCclassIIの発現をFACSを使用してS1P刺激無しのコントロールと比較検討する。また、活性化したマクロファージからのTNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌をELISA法により定量し、S1Pの刺激の有無で比較検討する。
最後に、S1PRアゴニスト/アンタゴニストによるLPS誘導性のALI/ARDSの治療実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
炎症細胞の単離培養のアッセイ系の確立に時間がかかり、このアッセイ系の開始に至らなかったため好中球とマクロファージの活性化に与えるS1Pの影響の解析、好中球の遊走能に与えるS1Pの影響の解析、活性化した好中球からの組織傷害因子の放出に与えるS1Pの影響の解析等の実験が出来ず、次年度使用額が生じた。次年度使用額は上記の解析ならびに血管内皮細胞株を使用した炎症性サイトカインの解析に使用する。
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