肺サーファクタント蛋白質Dによる変異型EGFR制御機構の解明と臨床応用

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K19461
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 長谷川 喜弘 札幌医科大学, 医学部, 助教 (90643180)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 肺サーファクタント蛋白質 / EGFR / 肺がん

研究実績の概要

申請者はこれまでに、肺サーファクタント蛋白質D (SP-D) が野生型上皮増殖因子受容体 (EGFR) の細胞外ドメインに存在する高マンノース型糖鎖に結合し、EGFRのリガンド結合を阻害することで、EGFシグナルを抑制し肺がん細胞の進展を抑制することを明らかにした。また変異型EGFRの肺腺がん患者の解析において、治療前の血清SP-D高値群では全生存期間が有意に延長していることがわかった。本申請課題ではSP-Dの変異型EGFRに対するシグナル抑制作用の機序を解明し、臨床応用につながる知見を得ることを目的とした。
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）感受性のヒト肺線がん細胞株HCC827細胞 (エクソン19欠失：del19) 、H3255細胞（L858R）、TKI耐性のH1975細胞（L858R/T790M）において、SP-DはEGFRリン酸化と下流シグナルを抑制した。del19、L858R、del19/T790M、L858R/T790Mの各変異型EGFRを強制発現させたCHOK1細胞でも同様の結果が得られた。SP-DはHCC827細胞、H3255細胞、H1975細胞の増殖を抑制した。クロスリンキングアッセイでは、SP-Dは変異型EGFRのリガンド依存性および非依存性の二量体形成を阻害した。ゲフィチニブ感受性のHCC827細胞、H3255細胞に対して、SP-Dとゲフィチニブを併用すると単独投与と比較して、細胞増殖がより抑制された。ゲフィチニブ耐性のH1975細胞に対しては、T790Mにも感受性を持つ第3世代EGFR-TKI（ロシレビニブ、WZ4002）とSP-Dを併用したが、単独投与と比較して細胞増殖がより抑制され、SP-DとEGFR-TKIには相加効果があると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

SP-DはTKI感受性の変異型EGFRシグナルを抑制することを明らかにしたが、TKI耐性のH1975細胞およびDel19/T790M、L858R/T790Mの各変異型EGFRを強制発現させたCHOK1細胞に対しても、SP-Dがシグナル抑制作用を示すことを確認することが出来た。さらに二量体形成が阻害される細胞内キナーゼドメインの点変異 (L704RとI941R)をdel19、L858R、del19/T790M、L858R/T790Mといった各変異型EGFRに追加導入し、CHOK1細胞へ安定発現させることが出来た。これまでの報告どおり、del19やT790Mは二量体に依存せずにEGFRリン酸化が検出できることを確かめた。また肺がん患者の手術検体の免疫染色を開始することが出来た。以上より、当初の計画以上に研究が進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

(1)二量体形成に依存せず活性化するdel19/I706、del19/V948R、del19/T790M/I706Q、del19/T790M/V948R、L858R/T790M/I706Q、L858R/T790M/V948Rといった変異型EGFR安定発現CHOK1細胞に対して、EGFRの自己リン酸化をSP-Dが抑制するかを検討する。
(2)EGFR-TKI耐性化の機序として、肝細胞増殖因子を介する (HGF/MET) シグナルの増強も重要だが、HGFやMETも糖鎖を有する糖タンパク質であるためSP-Dが結合する可能性があり、両者の相互作用を解析する。
(3)前年度に開始した肺がん患者の手術検体の免疫染色の解析を行う。
(4)HCC827細胞をヌードマウスの背部へ皮下移植し、リコンビナントSP-Dを尾静脈から投与することで腫瘍形成が抑制されるか解析する。

次年度使用額が生じた理由

研究が予定よりも早く進展していたためと、申請者が所属する研究室で使用していたフリーザーが故障し早急に買い換える必要が生じたため、前倒し請求を行った。しかしフリーザーは申請者が所属する研究機関内の別の予算で購入することができることになったため、残額は次年度使用額とすることとした。

次年度使用額の使用計画

実験に必要な抗体や試薬の多くは購入しているので、次年度使用額は不足した試薬を購入したり、消耗品の購入に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Surfactant Protein A Inhibits Growth and Adherence of Uropathogenic Escherichia coli to Protect the Bladder from Infection. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto J, Takahashi M, Saito A, Murata M, Kurimura Y, Nishitani C, Takamiya R, Uehara Y, Hasegawa Y, Hiyama Y, Sawada N, Takahashi S, Masumori N, Kuroki Y, Ariki S.
  • 雑誌名: J Immunol. 巻: 198 ページ: 2898-2905
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1502626
  • 査読あり
• [雑誌論文] Surfactant protein A (SP-A) and SP-A-derived peptide attenuate chemotaxis of mast cells induced by human β-defensin 3. (2017)
  • 著者名/発表者名: Uehara Y, Takahashi M, Murata M, Saito A, Takamiya R, Hasegawa Y, Kuronuma K, Chiba H, Hashimoto J, Sawada N, Takahashi H, Kuroki Y, Ariki S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 485 ページ: 107-112
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.02.028.
  • 査読あり
• [雑誌論文] SP-Dによる変異型EGFR肺がんの制御機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘, 梅田泰淳, 大塚満雄, 有木茂, 高宮里奈, 齋藤充史, 黒沼幸治, 千葉弘文, 高橋弘毅, 黒木由夫, 高橋素子
  • 雑誌名: 分子呼吸器病 巻: 21 ページ: 80-83
• [雑誌論文] SP-DによるEGFR制御機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘、高橋素子、高橋弘毅
  • 雑誌名: BIO Clinica 巻: 14 ページ: 130-134
• [雑誌論文] 肺サーファクタント蛋白質SP-Dの肺がんに対する新たな役割 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘、高橋素子、高橋弘毅
  • 雑誌名: Medical Science Digest 巻: 42 ページ: 398-402
• [雑誌論文] N-glycans of growth factor receptors: their role in receptor function and disease implications. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Hasegawa Y, Gao C, Kuroki Y, Taniguchi N
  • 雑誌名: Clinical Science 巻: 130 ページ: 1781-1792
  • DOI: 10.1042/CS20160273.
  • 査読あり
• [雑誌論文] SP-A及びSP-A由来ペプチドはヒトβ-ディフェンシン3による肥満細胞の遊走を抑制する (2016)
  • 著者名/発表者名: 有木茂, 上原康昭, 村田雅樹, 高宮里奈, 長谷川喜弘, 齋藤充史, 千葉弘文, 黒沼幸治, 高橋素子, 高橋弘毅, 黒木由夫
  • 雑誌名: 分子呼吸器病 巻: 20 ページ: 120-123
• [学会発表] 肺サーファクタント蛋白質Dによる変異型EGFRの制御機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘, 佐久間裕司, 高橋素子
  • 学会等名: 第75回日本癌学会学術総会, 2016年10月6日～8日
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [学会発表] 肺サーファクタント蛋白質DによるEGFR遺伝子変異陽性肺がんの制御機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘, 高橋素子, 有木茂, 高宮里奈，齋藤充史, 高橋弘毅
  • 学会等名: 第114回北海道癌談話会例会
  • 発表場所: 札幌医科大学（札幌市）
  • 年月日: 2016-09-03 – 2016-09-03
• [学会発表] SP-Dによる変異型EGFR肺がんの制御機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷川喜弘, 梅田泰淳, 高橋素子, 大塚満雄, 有木茂, 高宮里奈，齋藤充史, 高橋弘毅, 黒木由夫
  • 学会等名: 第15回肺サーファクタント分子病態研究会
  • 発表場所: 札幌医科大学（札幌市）
  • 年月日: 2016-06-04 – 2016-06-04