| 研究課題/領域番号 |
16K19479
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
福住 好恭 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20609242)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ポドサイト / スリット膜 / Ephrin-B1 / Par-6 / NHERF2 |
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| 研究実績の概要 |
ポドサイトにおける新規Ephrin-B1関連分子を同定するため、ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いた次世代シーケンサ解析を行った。その結果、Tight Junction関連分子であるPar-6を同定した。リアルタイムPCR法、及び免疫染色法による解析で、Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体でPar-6の発現低下が確認され、Par-6はEphrin-B1の関連分子であることが示された。
ポドサイトにおけるEphrin-B1とPar-6との関係を詳細に解析したところ、正常ラット糸球体でEphrin-B1とPar-6が共局在すること、蛋白尿を呈するネフローゼ症候群モデルラット糸球体で、病態誘導初期でEphrin-B1とPar-6の染色性の低下を発見した。発達期糸球体では、Ephrin-B1とPar-6はNephrin発現がまだ観察されないS字管期初期糸球体で発現が観察された。
HEK293細胞を用いた強制発現系の解析で、Ephrin-B1はPar complexの１つであるPar-3とは結合せず、Par-6と結合することを明らかにした。また、抗Nephrin抗体刺激によってリン酸化されたEphrin-B1は、Par-6と結合しないことを明らかにした。以上の結果から、Ephrin-B1とPar-6の相互作用が、ポドサイトスリット膜の機能維持に重要であることを示した。
また、Ephrin-B1と関連するPDZ domainを有する蛋白質を同定するため、Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いて次世代シーケンサ解析を行ったところ、Ephrin-B1ノックアウトマウスで発現量に変化があったPDZ domain蛋白質NHERF2を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度では、Ephrin-B1とPar-6の相互作用を詳細に解析した。ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体で、Par-6の発現低下を観察した。正常ラット糸球体では、Ephrin-B1とPar-6の共局在、NephrinとPar-3の共局在を観察した。ネフローゼ症候群モデルラット糸球体では、病態誘導初期でEphrin-B1とPar-6の染色性の低下、蛋白尿ピーク時でNephrinとPar-3の染色性の低下を観察した。発達期糸球体では、Ephrin-B1とPar-6はNephrin発現がまだ観察されないS字管期初期糸球体で発現が観察された。
HEK293細胞を用いた強制発現系の解析で、Ephrin-B1はPar-3と結合せず、Par-6と結合すること、NephrinはPar-6と結合せず、Par-3と結合することを明らかにした。抗Nephrin抗体刺激によりリン酸化されたEphrin-B1は、Par-6と結合できないことを明らかにした。スリット膜特異的障害モデルある抗Nephrin抗体誘導腎症では、病態誘導1時間後からEphrin-B1がリン酸化されることから、Ephrin-B1とPar-6の結合が維持できず、スリット膜の構造が変化して、蛋白尿が発症することを示した。
また、PDZ binding domainを有するEphrin-B1と関連するPDZ domain蛋白質を同定するため、Ephrin-B1ノックアウトマウス単離糸球体材料を用いた次世代シーケンサ解析で、PDZ domain蛋白質NHERF2を同定した。
以上より、ポドサイトにおけるEphrin-B1とPar-6の相互作用を明らかにしたこと、Ephrin-B1関連PDZ domain蛋白質、NHERF2を同定したことから、本年度計画は順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次世代シーケンサ解析により同定したNHERF2の解析を行う。具体的には、ポドサイトにおけるEphrin-B1とNHERF2との関係を明らかにするため、ポドサイト特異的Ephrin-B1ノックアウトマウス糸球体におけるNHERF2の発現解析を、リアルタイムPCR法、及び免疫染色法で検討する。また、正常ラット糸球体におけるEphrin-B1とNHERF2の局在解析を二重免疫染色法により解析する。
Ephrin-B1とNHERF2の相互作用を、HEK293細胞を用いた強制発現系により解析する。Ephrin-B1とNHERF2の相互作用がPDZ domainを介しているかどうかを明らかにするため、PDZ binding domain欠損Ephrin-B1ベクターを作製し、NHERF2との結合を免疫沈降法により検討する。また、NHERF2は２つのPDZ domainを有しており、Ephrin-B1がどのPDZ domainと結合するかを明らかにするため、それぞれのPDZ domain欠損NHERF2ベクターを作製し、Ephrin-B1との結合を免疫沈降法により検討する。Ephrin-B1とNHERF2の結合が観察された場合、抗Nephrin抗体刺激によるリン酸化Ephrin-B1とNHERF2が結合するかどうかを、NHERF2/Ephrin-B1/NHERF2のトリプルトランスフェクション材料を用いて検討する。
ネフローゼ症候群モデルラット糸球体におけるNHERF2の免疫染色染色を行い、蛋白尿発症にNHERF2の発現変化が関与しているかどうかを明らかする。NHERF2の発現変化が観察された場合、Ephrin-B1との二重染色を行い、Ephrin-B1との関連性を解析する。また、糸球体形成期におけるNHERF2の発現様式を検討するため、発達期糸球体におけるNHERF2の免疫染色を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究が順調に進んだため、さらなる解析に必要な遺伝子改変マウスの飼育経費、及び相互作用解析に必要な試薬を購入するため。
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