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メトトレキサート(MTX)は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)を標的する葉酸代謝阻害剤として開発された薬剤で、1950年代から急性白血病の治療に用いられてきた。その後、骨破壊の進行抑制作用を示すことがわかり、長期にわたる有効性と安全性から、現在、関節リウマチ治療の第一選択薬、アンカードラッグとして広く用いられている。MTXの薬理作用は、複数の免疫抑制及び調節効果の結果と考えられているが、DHFRに対する阻害効果だけでは、その薬効を全て説明することはできない。本研究は、免疫系におけるMTXの薬理作用解明を目指し、MTXの新規標的タンパク質の探索と同定を行い、その機能の検討を目的とする。平成29年度までに、MTXに対して特異的な結合を示す炎症関連タンパク質を複数同定することに成功しており、大腸菌を用いたリコンビナント体の作製を行った。また、MTX固定化セファロース担体を用いたpull-downアッセイにより、それら炎症関連タンパク質のリコンビナント体が、MTXに特異的に結合することを明らかにした。さらに、炎症関連タンパク質Aに着目して、MTXとの複合体のX線結晶構造解析を行い、MTXと炎症関連タンパク質Aの結合様式を分子レベルで明らかにした。平成30年度は、等温滴定型カロリメトリーにより、炎症関連タンパク質Aに対するMTXの結合数及び解離定数を求めた。また、炎症関連タンパク質Aに高い構造類似性を示す炎症関連タンパク質Bの大腸菌によるリコンビナント体を作製し、MTXとの相互作用解析を行った。炎症関連タンパク質Aと比較して、炎症関連タンパク質Bの構造及び活性に対するMTXの影響は小さかったことから、MTXは炎症関連タンパク質Aの活性を特異的に阻害する可能性があることが示唆された。
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