| 研究課題/領域番号 |
16K19632
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
吉田 昌平 金沢大学, 附属病院, 助教 (30623657)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ダノン病 / XIST |
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| 研究実績の概要 |
既に作成した女性ダノン病患者Tリンパ球より樹立したiPS細胞より、正常LAMP2mRNAを発現するクローン、異常LAMP2mRNAを発現するクローンのクローニングを行い、2013年のNature protocolに記載されたプロトコルを若干改変して適応することで、それぞれのクローンを心筋分化させることに成功した。
分化心筋に対するLAMP2の免疫染色では正常LAMP2mRNAをもつ分化心筋に対してはLAMP2の染色が認められたが、異常LAMP2mRNAを発現する分化心筋に対してはLAMP2蛋白の発現が認められなかった。ジストロフィン染色も行ったが、光学顕微鏡での観察においては差異を認めなかった。
表現型としては、透過電子顕微鏡での観察において異常LAMP2mRNAを持つ分化心筋ではその心筋細胞内に自己貪食空胞の存在が確認された。また、バキュロウイルスを用いたtandem fluorescent LC3 assayを行い、異常LAMP2mRNAを持つ分化心筋においてはファゴソームにライソソームが結合し、オートライソソームとなる過程での成熟不全が認められることを確認した。更にLC3に対するwestern blotでは、通常状態でのLC3-II分画の増加が異常mRNAを発現する分化心筋においては認められており、相対的にプロテアーゼインヒビターを使用しても、LC3-II分画の増加が認められないことを確認した。総合すると、異常LAMP2mRNAを発現している分化心筋においては、LAMP2の欠損によるオートファジー不全(特にライソソームのファゴソームへの結合不全)を確認することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CRISPER/Cas9でのXISTのノックアウトが成功しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPER/Cas9システムでのノックアウトは続けるが、成功しない場合も考慮し、XISTに対してsiRNAでノックダウンを行ってみる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CRISPR/Cas9でのXISTのノックアウトが成功せず、関連物品の購入が行われなかったことにより物品費が低く抑えられている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記CRISPR/Cas9関連物品を追加で購入する必要があるため、当該経費を充てる予定である。
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