2017 年度実施状況報告書

女性ダノン病iPS細胞由来心筋を用いたXISTの役割と遺伝子治療の可能性について

研究課題

研究課題/領域番号	16K19632
研究機関	金沢大学
研究代表者	吉田昌平金沢大学, 医学系, 助教 (30623657)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	ダノン病 / iPS細胞 / XIST
研究実績の概要	既に作成した女性ダノン病患者Tリンパ球より樹立したiPS細胞より、正常LAMP2mRNAを発現するクローン(WT)、異常LAMP2mRNAを発現するクローン(MT)のクローニングを行い、心筋分化させることに成功した。分化心筋に対するLAMP2の免疫染色ではWTから作成した分化心筋(WT-iPSC-CMs)に対してはLAMP2の染色が認められたが、MTから作成した分化心筋(MT-iPSC-CMs)に対してはLAMP2蛋白の発現が認められなかった。ジストロフィン染色も行ったが、光学顕微鏡での観察においては差異を認めなかった。表現型としては、透過電子顕微鏡での観察においてMT-iPSC-CMsではその心筋細胞内に自己貪食空胞の存在が確認された。また、バキュロウイルスを用いたtandem fluorescent LC3 assayを行い、MT-iPSC-CMsにおいてはファゴソームにライソソームが結合し、オートライソソームとなる過程での成熟不全が認められることを確認した。更にLC3に対するwestern blotでは、通常状態でのLC3-II分画の増加がMT-iPSC-CMsにおいては認められており、相対的にプロテアーゼインヒビターを使用しても、LC3-II分画の増加が認められないことを確認した。フローサイトによる死細胞の量も確認したが、本実験系においてはLAMP2の異常の有無による死細胞の量の変化は認められなかった。以上の差異について、ヒトアンドロゲンレセプター抗体のCAGリピートを用い、X染色体の不活化の差異が反映されているということを証明した。本研究はJ Mol Cell Cardiol. 2018 Jan;114:234-242. doi: 10.1016/j.yjmcc.2017.11.019.に発表された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 CRISPR/Cas9システムによるXISTのノックアウトを行ったiPS細胞のクローンが樹立できない。siRNAでのノックダウンに関してはまだ行えていない。
今後の研究の推進方策	siRNAによるノックダウンは一時的なものであり、表現型の再現が困難な可能性が示唆されるため、CRISPR/Cas9でのノックダウンを継続する。今までの研究成果に関しては海外学会で発表を予定している。
次年度使用額が生じた理由	海外学会での発表を予定していたが、本年度は発表の機会がなかった。次年度に予定する。