| 研究実績の概要 |
29年度は細胞レベルでの肝虚血再灌流障害(I/RI)治療としてAdipose tissue derived stem cells (ADSCs)の全身投与による肝障害保護効果を確認するために in vitroにおけるADSCsによる肝細胞保護効果とNrf2 pathway関連解明を行った。肝細胞株をADSCs と細胞接触のない状態でTranswell で共培養し、肝細胞のCell Viabilityとともに、confocal microscopyによる活性化Nrf2 (nuclear translocation)、HSP(HO-1)発現、抗酸化酵素発現(SOD, prdx1)、metaboksim (ATP/ADP)、NO関連因子(eNOS, iNOS)、apoptosis (TUNEL染色、caspase 3発現)、培養液中の各種サイトカイン(IL-1. IL-6、TNF-α、Nf-kb)を非共培養群と経時的に追跡比較しており、現在I/RIの至適実験条件につき検討中である。(Group)1. Normoxic conditions A. Hepatocyte + PBS B. Hepatocyte + ADSC 2. Hypoxic conditions A. Hepatocyte + PBS B. Hepatocyte + ADSC（Protocol）1. 肝細胞培養：6-well dishes at 50x104 cells/well, overnight.2. ① ADSC 10x104 cells/well ②PBS (control)3. 低酸素chamberで培養 5% CO2, 21% O2, balanced with N2 (95% humidity)4. Normoxic conditions chamberをクランプし90分
Hypoxic conditions 5% CO2 and 95% N2 at 0.1-0.13 Mpa for 4 minutes (100L)、シールして90分 5. 開放し24時間培養（Parameters）1. IF ( confocal microscopy): nuclear translocation of Nrf2
2. Cell viability: 3x104 cell 3. ROS assay kit (ABCAM): 3x104 cell 4. WB (Nrf2 nucleus): 500x104 cell 5. RT-PCR: 30x104 cell Anti-oxidant expression (HO-1, CAT) Inflammatory (Nfk-b, TNF-a)6. MDA
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| 今後の研究の推進方策 |
in vitroでの結果を確認次第、肝I/RI modelを用いたADSCs投与による肝保護作用とNrf2 pathwayの関連の検討を行う予定である。
8週齢雄性 balb/c nu-nu mouseにADSCS 1.0×105を経静脈的に投与し、全肝15分間虚血後に再灌流後、2・4・6・12・24・48時間後に犠死させ血液・肝組織を採取する。検討項目；1.肝組織中のADSCsのlocation確認(IF)。2.肝重量再生率、PCNA labeling index、BrdU labeling index。3.肝障害評価：血清肝機能（AST/ALT/LDH/T-bil）、肝障害score (HE stain: Suzuki’s score)。4.Nrf2活性化評価: IF (confocal microscopeによるnuclear translocationの確認)WBによるnucleus Nrf2のADSCs投与による継時的発現増強の確認。5.酸化障害評価：血性、肝組織中MDA定量。6.HSP、抗酸化酵素発現の検討：Nrf2のtarget geneであるHSP(HO-1)発現、抗酸化酵素発現(SOD, prdx1)を遺伝子、蛋白レベルで検討する(qRT-PCR, WB, IHC)。7.Apoptisus評価：肝組織のapoptotic index (TUNEL染色)、caspase-3のqRT-PCR, WBを行う。8.Metabolism：肝組織中ATP/ADP比 (ELISA)。9.各種炎症mediator：各種サイトカイン(IL-1. IL-6、TNF-α、Nf-kb)、MPOをELISAで評価。また肝組織のIHC(CD11b、Gr-1、CD8、CD4)により浸潤細胞の評価を行う。
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