脂肪酸代謝、酸化ストレスを介したNAFLD/NASH肝細胞癌の発癌・進展機構解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K19939
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 中川 茂樹 熊本大学, 医学部附属病院, 寄附講座教員 (10594872)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: NAFLD / NASH / 肝細胞癌 / 癌代謝 / 脂肪肝

研究実績の概要

肝細胞癌の主な原因肝疾患としてC型肝炎、B型肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝（炎）[Non-alcoholic fatty liver disease:NAFLD (Non-alcoholic steatohepatitis:NASH)]が知られている。中でもNAFLD（NASH）は主に欧米で増加している疾患として知られていたが、近年本邦においてもその罹患率は増加しつつあり、NAFLD（NASH）から発生した肝細胞癌も増加している。近年、Transmembrane 6 superfamily member 2 (TM6SF2) がNAFLDからNASHへの進展を予測する因子として同定され、NAFLD（NASH）及び動脈硬化性疾患のリスクファクターとして有用であることが報告された（Nat Genet. 2014, Hepatology. 2015）。本研究ではTM6SF2のNASH-HCC発癌における役割を明らかにする事を目的とする。
我々はこれまでに、パブリックデータベースを用いた解析を行い、TM6SF2の機能解析を行ってきた。NASH肝組織のマイクロアレイデータベース（GSE49541）を用いて、TM6SF2高発現症例において発現が上昇している遺伝子セットをGSEA (Gene Set Enrichment Analysis)を用いて解析したところ、TM6SF2高発現症例において脂肪酸代謝、酸化的リン酸化、アディポジェネシス等が亢進している事が明らかとなり、TM6SF2がこれらの反応を制御している可能性が示唆された。また、肝細胞癌組織のマイクロアレイデータベースであるGSE9843、GSE16757を用いた解析においてもTM6SF2高発現症例において脂肪酸代謝、アディポジェネシス等が亢進しており、これらの代謝経路を介して肝細胞癌の悪性度に寄与している事が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度はパブリックデータベースを用いたBioinformaticsの手法を用いた解析を主として行った。これにより臨床検体におけるTM6SF2の酸化ストレス及び脂肪酸代謝との相関が明らかになった。また、昨年度は肝組織、または腫瘍組織のスライスを培養するex-vivo培養系のセットアップを行った。培養系は確立出来ており、次年度より薬剤を用いた実験を開始する事が出来る。
これらの事より実験はおおむね順調に経過していると考えられる。

今後の研究の推進方策

まずは、肝細胞癌細胞株を用いたIn vitroの実験によって、TM6SF2の癌細胞における働きを明らかにする。当科にて保有している8種類の肝細胞癌細胞株に対して、TM6SF2発現プラスミドベクターを導入し、TM6SF2強制発現を、TM6SF2を標的としたsiRNAを用いて発現抑制を行った細胞株を作成し、機能解析を行う。MTT assay にて増殖能、invasion assayにて浸潤能、scratch assayにて遊走能に与える影響を明らかにする。また、FACSを用いた解析を行い、アポトーシス細胞を検出し、TM6SF2がアポトーシスおよび細胞周期に与える影響を分析する。更に、我々の解析によりTM6SF2高発現が脂肪酸代謝に影響を与える事が示唆される。これを確認するため、コレステロール、アセチルCo-A定量により脂肪酸代謝を、H2O2やグルタチオンを測定することで脂肪酸の代謝に伴う酸化ストレスの変化を評価する。
続いて、ex-vivo培養系を用いた実験を行う。手術による切除後すぐの肝細胞癌組織および背景肝組織を、マイクロトームを用いて厚さ300μmにスライスし、細胞培養用メディウムを用いて培養を行う。この組織に対して各種薬剤を投与し、MTSアッセイにてそのviabilityを、カルチャー後の蛋白、mRNAを回収してその蛋白、遺伝子発現の変化を評価する。このようなex vivoの実験系を用いてヒト肝細胞癌組織/背景肝組織に対する薬剤の効果を評価することで、肝星細胞を中心とする間質細胞や微小血管などの腫瘍微小環境を残しつつ、薬剤感受性の評価を行う事が可能である。本研究では、NAFLD（NASH）の治療薬として期待されているスタチン、メトフォルミン、ペレチノインの効果を主に検証する。

次年度使用額が生じた理由

医局内保管の試薬、消耗品を使用することができたため。

次年度使用額の使用計画

次年度より薬剤を用いた実験を開始するため、多くの試薬が必要となる。研究費は主にその購入費に充てたい。また、最新の研究情報を得るため、及び研究成果発表のための学会出張旅費にも充てたいと考える。

研究成果

• [雑誌論文] Selective Venous Occlusions for Reducing Blood Loss During Right Anterior Sectionectomy of the Liver for Hepatocellular Carcinoma. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamashita Y, Imai K, Tsujita E, Kaida T, Yamao T, Umezaki N, Nakagawa S, Hashimoto D, Chikamoto A, Baba H.
  • 雑誌名: J Am Coll Surg 巻: 224(2) ページ: e5-e9
  • DOI: 10.1016/j.jamcollsurg.2016.10.035.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pre-treatment double- or triple-positive tumor markers are predictive of a poor outcome for patients undergoing radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma. (2017)
  • 著者名/発表者名: itta H, Nakagawa S, Kaida T, Arima K, Higashi T, Taki K, Okabe H, Hayashi H, Hashimoto D, Chikamoto A, Ishiko T, Beppu T, Baba H.
  • 雑誌名: Surg Today 巻: 47(3) ページ: 375-384
  • DOI: 10.1007/s00595-016-1385-6.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Preoperative platelet-to-lymphocyte ratio can predict recurrence beyond the Milan criteria after hepatectomy for patients with hepatocellular carcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaida T, Nitta H, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Higashi T, Taki K, Nakagawa S, Okabe H, Hayashi H, Imai K, Hashimoto D, Yamashita YI, Chikamoto A, Ishiko T, Beppu T, Baba H.
  • 雑誌名: Hepatol Res 巻: Epub ahead of print ページ: Epub
  • DOI: 10.1111/hepr.12835.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Liver Cancer Prevention in Cirrhosis by Organ Transcriptome Analysis and Lysophosphatidic Acid Pathway Inhibition. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa S, Higashi T, Goossens N, Bain G, Lauwers GY, Koh AP, El-Abtah M, Ahmad NB, Hoshida H, Erstad DJ, Gunasekaran G, Lee Y, Yu ML, Chuang WL, Dai CY, Baba H, Mahajan M, Nair VD, Lanuti M, Iavarone M, Colombo M, Llovet JM, Tager AM, Schwarz ME, Chung RT, Tanabe KK, Zhang B, Fuchs BC, Hoshida Y, et al.
  • 雑誌名: Cancer Cell 巻: 30(6) ページ: 879-890
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2016.11.004.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Palbociclib (PD-0332991), a selective CDK4/6 inhibitor, restricts tumour growth in preclinical models of hepatocellular carcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Bollard J, Miguela V, Ruiz de Galarreta M, Venkatesh A, Bian CB, Roberto MP, Tovar V, Sia D, Molina-Sanchez P, Nguyen CB, Nakagawa S, Llovet JM, Hoshida Y, Lujambio A.
  • 雑誌名: Gut 巻: Epub ahead of print ページ: Epub
  • DOI: 10.1136/gutjnl-2016-312268.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Nonalcoholic Steatohepatitis Is Associated With Increased Mortality in Obese Patients Undergoing Bariatric Surgery. (2016)
  • 著者名/発表者名: Goossens N, Hoshida Y, Song WM, Jung M, Morel P, Nakagawa S, Zhang B, Frossard JL, Spahr L, Friedman SL, Negro F, Rubbia-Brandt L, Giostra E
  • 雑誌名: Clin Gastroenterol Hepatol. 巻: 14(11) ページ: 1619-1628
  • DOI: 10.1016/j.cgh.2015.10.010.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Statin attenuates cell proliferative ability via TAZ (WWTR1) in hepatocellular carcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Higashi T, Hayashi H, Kitano Y, Yamamura K, Kaida T, Arima K, Taki K, Nakagawa S, Okabe H, Nitta H, Imai K, Hashimoto D, Chikamoto A, Beppu T, Baba H.
  • 雑誌名: Med Oncol 巻: 33(11) ページ: 123
  • DOI: 10.1007/s12032-016-0845-6
  • 査読あり