| 研究課題/領域番号 |
16K20131
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
小林 憲市 滋賀医科大学, 医学部, 非常勤講師 (40727434)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | カニクイザル / ES細胞 / ノックイン |
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| 研究実績の概要 |
昨年度、報告したようにカニクイザルのES細胞はヒトiPS細胞とは全く異なる挙動を示し、腎分化の誘導が困難であったため、分化条件の調整を行ったが、やはりある程度細胞増殖が進むと、分化誘導がうまくいかず、また目的の分化の前の細胞増殖のスピードが上回り、モザイクな分化を示してしまった。その後の実験で、腎分化においてはWnt pathway を誘導するため人GSK inhibitorを使用するが、カニクイザルES細胞はその分化能を維持するため、維持培養系において、Wnt pathwayを阻害して培養するため、ヒトiPS,と同じ強度の誘導では弱いことがわかったが、Wntの阻害をやめたしと同時に細胞の多能性が低下し、目的外の分化が誘導されることがわかった。そこで、分化誘導前に、多能性を維持した高品質なカニクイザルES細胞を樹立し、そこから分化誘導実験を行う方針とし、多能性に重要なOCT3/4に,tdTomatoとzeocin耐性遺伝子をヘテロノックインし、多能性を維持した細胞の可視化と選抜が可能なCell linesの作成をした。
新たに樹立した細胞が多能性を維持していることを確認するため、奇形腫形成能の確認とqPCRを行った。
昨年作成したCell lineには一部で染色体異常を認めたため、染色体解析を行い、Resourceとして問題ない細胞であることを確認した。
このCell lineについては学術誌Stem cell researchにその成果を報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初はカニクイザルES細胞を用いた腎分化の研究を行い、移植実験まで持ち込む予定であったが、カニクイザル多能性幹細胞の挙動が、報告されているヒトやマウスのES細胞とあまりに異なるため、カニクイザル多能性幹細胞の性質と特徴を確認するのに時間を要した。また、培養条件から、多能性の維持、分化能の維持が困難であることがわかり、分化実験に耐えうるCell lineの樹立を余儀なくされ、その研究に多くの時間を必要と認め、当初の目的を達成することはできなかった、
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| 今後の研究の推進方策 |
今回樹立した細胞を用いて、腎分化の実験を行い、移植に耐えうるオルガノイドの形成を目的とする。また、免疫寛容が成立する細胞での同様のcell lineの樹立、オルガノイドの形成を目指し、実際に移植実験が可能な環境を整備する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
カニクイザルES細胞の特異性から、実験計画が大幅に変更になったため、論文作成が年度末になり、学会発表などの旅費が発生しなかった。またカニクイザルそのものを使用する実験がなかったため、個体購入費用がかからなかった、
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