RSウィルス下気道炎発症予測のための疾患特異的microRNAの有用性の検討

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K20266
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 山本 圭佑 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (50738515)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: RS ウイルス / 自然免疫 / クラリスロマイシン / IRF-3

研究実績の概要

RSウイルスが誘導するmicroRNAの役割を評価するために,様々な上皮細胞におけるRSウイルス感染系,real-timePCRによるコピー数,ウイルスタイター測定の適正化などを行った.さらにRSウイルスが気道上皮細胞に感染を引き起こすことに伴って誘導される宿主細胞の自然免疫応答を担うシグナル伝達経路に関して検討を行った.
hTERT導入ヒト鼻粘膜細胞において,RSV感染によりIL-6, 8, CCL5の産生が誘導され,肺胞上皮細胞株であるA549細胞ではRSV感染によってtype I, III interferon(IFN)-β,-λ1,-2,-3が誘導された.これらのサイトカイン産生はCAM投与によって有意に抑制された.転写因子活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子法を用いて検討した。A549にRSV感染を行うと,IFN-β P-125(IFN-βプロモーター領域)とPRD III-I(IRF-3の結合領域の制御下にあるレポーター遺伝子)は活性化され,CAMによって有意な抑制された.そこで,これまで報告のないCAM投与によるIRF-3活性化への抑制効果に焦点をあてて検討を行った.IRF-3はRSV感染にリン酸化を受けるが,CAM処置はこのリン酸化に影響を与えなかった.次にIRF-3の細胞内局在をRSV感染の有無とCAM投与の影響に分けて免疫染色で検討した.RSV感染によりIRF-3の細胞質から核への移行が観察されたが,CAM処置によりIRF-3の核移行が有意に阻害された.さらにIRF-3の二量体形成に関するCAM投与の影響を検討した.RSV感染により二量体形成の誘導が見られたが,CAM処置により二量体形成は抑制された.これらの結果から,CAMはRSVにより誘導されるIRF-3の二量体形を抑制することで,それに伴う核移行を抑制しシグナル伝達経路を止めていることが示唆された.

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

以上の成果を Clarithromycin prevents human respiratory syncytial virus-induced airway epithelial responses by modulating activation of interferon regulatory factor-3.として国際学術誌に投稿し受理された。
鼻汁中の RS ウイルス量と microRNA の関係を検討するために、鼻汁中の RS ウイルスのコピー数を定量 PCR を用いて算出する系を確立した。またRS ウイルスの定量はプラーク法(PFU/ml)を用いて行うことが一般的であるが、手技が比較的難しく、施設間でのばらつきも大きい。そのためコピー数をもとに PFU/ml を算出する系を確立した。これらの系を用いて、提供された鼻汁検体から定量PCR法を用いて、推定 PFU/ml を算出しプラーク法の適正評価を行った。また microRNA 検討においてmicroRNA array の結果をもとに、 reference microRNA となる候補 microRNA を選出し、鼻汁における分泌型microRNAのreference microRNAとなりうるか検討を行った。この結果をもとに検体量、濃度に差異のある臨床検体を画一的に定量できる系を確立した。

今後の研究の推進方策

microRNA arrayで上昇が見られた microRNA を実際的に定量していく。あくまで臨床検体であることから、実験的に用いる際の実際的な濃度や、検体量に関して検討を重ねていく必要がある。疾患特異的な microRNA の候補を検討するために RS ウイルスのほかに mumps ウイルスなども検討を行う予定である。また、これまで確立させたウイルス量との関係を明らかにしていきたい。

次年度使用額が生じた理由

・計画が順調に遂行できているため、試薬類については予定通りの使用額となっている。
・成果発表が地元での開催であったため、旅費について計上した予算以下で成果発表が可能であったため。

次年度使用額の使用計画

・新たな候補となりうる microRNA、real-timePCRの試薬購入費に充てたい・国内学会での成果発表を予定しており、旅費を経費として計上する。・成果を論文としてまとめて報告するにあたり、英文校正料、国際学術誌への投稿料に充てる。

研究成果

• [雑誌論文] Mitochondrial proteins NIP-SNAP-1 and -2 are a target for the immunomodulatory activity of clarithromycin, which involves NF-κB-mediated cytokine production. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto S, Ogasawara N, Yamamoto K, Uemura C, Takaya Y, Shiraishi T, Sato T, Hashimoto S, Tsutsumi H, Takano K, Himi T, Yokota SI.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 483 ページ: 911-916
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.12.100. Epub 2016 Dec 18.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Clarithromycin prevents human respiratory syncytial virus-induced airway epithelial responses by modulating activation of interferon regulatory factor-3. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto K, Yamamoto S, Ogasawara N, Takano K, Shiraishi T, Sato T, Miyata R, Kakuki T, Kamekura R, Kojima T, Tsutsumi H, Himi T, Yokota S.
  • 雑誌名: Pharmacol Res. 巻: 111 ページ: 804-814
  • DOI: doi: 10.1016/j.phrs.2016.07.033. Epub 2016 Jul 26.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Mumps Virus Induces Protein-Kinase-R-Dependent Stress Granules, Partly Suppressing Type III Interferon Production. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto S, Yamamoto S, Ogasawara N, Sato T, Yamamoto K, Katoh H, Kubota T, Shiraishi T, Kojima T, Himi T, Tsutsumi H, Yokota S.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 11 ページ: 1-18
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0161793. eCollection 2016.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] クラリスロマイシンは気道上皮でRSVによって誘導されるインターフェロンをIRF-3を介して調整する (2017)
  • 著者名/発表者名: 山本圭佑，小笠原徳子，高野賢一，宮田遼，角木拓也，亀倉隆太，氷見徹夫
  • 学会等名: 第118回日本耳鼻咽喉科学会通常総会・学術講演会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島県広島市）
  • 年月日: 2017-05-17 – 2017-05-20
• [学会発表] クラリスロマイシンは気道上皮細胞で RS ウイルスによって誘導されるインターフェロンの産生を IRF-3 を介して調整する (2017)
  • 著者名/発表者名: 山本圭佑, 小笠原徳子, 高野賢一, 氷見徹夫
  • 学会等名: 第35回日本耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会
  • 発表場所: 旭川グランドホテル（北海道旭川市）
  • 年月日: 2017-04-13 – 2017-04-15
• [学会発表] Clarithromycin prevents human respiratory syncytial virus-induced airway epithelial responses by modulating activation of interferon regulatory factor-3 (2016)
  • 著者名/発表者名: Keisuke Yamamoto, Hiroyuki Tsutsumi, Tetsuo Himi, Shin-ichi Yokota
  • 学会等名: 第64回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道札幌市)
  • 年月日: 2016-10-23 – 2016-10-25