研究課題
糖尿病網膜症や加齢黄斑変性症は中途失明に関わる疾患であり、その発症および進行には虚血および病的血管新生が密接に関連することが知られている。本研究では、既存血管に存在して血管新生に中心的な役割を果たす特殊な血管内皮細胞を同定し、血管新生との関連を解明することにより、血管新生を制御する新規治療法の開発を目指すことを目的としている。我々は、これまでの研究において、フローサイトメトリーおよび蛍光モノクローナル抗体を用いた精度の高い血管内皮細胞単離法を確立し、さらにDNA結合色素Hoechstを用いたSide population (SP)法を行い、血管新生の際に中心的な役割を果たす可能性のある潜在的増殖活性の高い血管内皮細胞として血管内皮SP細胞を同定した（EMBO J 2012, IOVS 2013）。さらにDNAマイクロアレイを用いてマウス血管内皮SP細胞に特異的に発現する分子としてCD157（Bst1）を新たに同定した。平成29年度の研究では、CD157で血管を免疫染色したところ、CD157陽性血管内皮細胞は毛細血管には存在しておらず、太い血管（主に静脈）に散在していることが分かった。CD157陽性の血管内皮細胞とCD157陰性の血管内皮細胞を回収し、Vitroで培養したところ、CD157陽性の血管内皮細胞は多数の血管内皮細胞を作り出す能力があることが分かった。また生体内において1個のCD157陽性血管内皮細胞が多数の血管内皮細胞からなる毛細血管を作り出すことが判明した。これらの成果は2018年Cell Stem Cell誌に報告した。CD157陽性の血管内皮細胞が実際に生体内で血管新生に貢献するかを調べるために、CD157遺伝子座に対してCreERT2コンストラクトを直接ノックインしたマウスを作製した。マウス作製と解析に時間を要し、現時点でCD157陽性血管内皮細胞を網膜や脈絡膜で標識することはできていないが、今後の検討によりCD157陽性血管内皮細胞をVivoで標識し、そこから血管新生が生じるかにつき検討を行う。
2: おおむね順調に進展している
血管新生に中心的な役割を果たす血管内皮SP細胞に最も特異性の高い遺伝子であるCD157（Bst1）を同定し、CD157陽性血管内皮細胞が太い血管に局在すること、CD157陽性血管内皮細胞が高い増殖活性を有し血管新生に貢献することを解明し、2018年Cell Stem Cell誌に報告した。
本研究において、CD157陽性血管内皮細胞が潜在的増殖活性を有し血管新生に中心的な役割を果たす血管内皮幹細胞であることがわかってきた。今後の研究方針として、CD157陽性血管内皮細胞が実際に血管新生に貢献するかを検証するため、マウス生体内でCD157を発現する細胞を蛍光タンパク質で標識することを試みる。方法として、Inducible Cre/loxPシステムを用いた細胞系譜解析（genetic lineage tracing）を検討する。CD157遺伝子座に対して、CreERT2コンストラクトを直接ノックインしたマウスを作製し、レポーターマウスと交配することでin vivoにおいてCD157陽性血管内皮細胞をEGFPで標識することを目指す。平成28年度、29年度においても同様の検討を試みたが、CD157陽性血管内皮細胞をEGFPで標識できなかった。原因としてサイレンシング等の影響が考えられた。このため、今後再びコンストラクトを作製し、CD157遺伝子におけるCreERT2挿入部位を変更してノックインマウスを再度作成する。ノックインマウスが作製できれば、CD157陽性血管内皮細胞をEGFPで標識した状態で血管新生を誘導し、EGFP陽性の血管内皮細胞の運命追跡（系譜解析）を行い、新たに構築される血管がEGFP陽性細胞から発生するかにつき検討を行う。さらに、シングルセル解析によるCD157陽性血管内皮幹細胞の遺伝子プロファイルの解析を行う。CD157陽性の血管内皮細胞の増殖活性制御に関わる遺伝子群を解析するため、Fluidigm C1 Systemおよび10x （Genomics社）を用いてCD157陽性血管内皮細胞のシングルセル解析を行い、細胞内シグナルの詳細の解明を目指したい。
本研究では、血管新生に中心的な役割を果たすCD157陽性血管内皮細胞を生体内で標識するため、CD157遺伝子座に対してCreERT2コンストラクトを直接ノックインしたマウスを作製したが、サイレンシングの影響からか生体内で標識することができなかった。このため、ノックインマウスの具体的な解析が進まなかった。今年度は、新たなノックインマウスを作製中であり、解析が進むことを目指している。
すべて 2018 2017
すべて 雑誌論文 (7件) (うち国際共著 1件、 査読あり 7件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 4件)
Cell Stem Cell
巻: 22 ページ: 384-397
10.1016/j.stem.2018.01.010.
British Journal of Ophthalmology
巻: - ページ: -
10.1136/bjophthalmol-2017-311689.
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol
na
Retina
10.1097/IAE.0000000000001828.
巻: 225 ページ: 2287-2291
10.1007/s00417-017-3771-1.
Cell Rep
巻: 20 ページ: 2072-2086
10.1016/j.celrep.2017.07.080.
巻: 255 ページ: 1737-1742
10.1007/s00417-017-3716-8.
