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緑内障や糖尿病網膜症など多くの視神経・網膜疾患において、網膜神経節細胞 (retinal ganglion cell; RGC)が障害されると、これによる視野や視力の障害を回復させる治療は現時点ではなく、神経保護療法や再生医療に期待が集まっているが、ヒトのRGCを得て研究することは容易ではなかった。その中でマウスやヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞 (induced pluripotent stem cell; iPS細胞)から立体的な網膜様組織を分化させる手法が近年発表された。この幹細胞由来の3次元網膜様組織は、視細胞、双極細胞、アマクリン細胞、RGCなどが胎生期の発生と類似したタイミングで分化し、眼胞・眼杯様の立体的構造を呈することが知られている。
これまでに、この幹細胞由来の3次元網膜様組織を用いて、RGCの軸索のみを選択的に伸長させる手法を確立し報告した。本研究では、更なる培養条件の最小化、最適化を試みることで、RGC軸索の伸長・維持に関連する因子を検討し、その下流因子の解析や阻害を行い、メカニズムを検証した。これまでに、分化RGCからの軸索伸長において、細胞外基質のラミニンが重要な役割を果たしていることを明らかにした。生理・薬理学的検討に備えて、本手法の簡易化・一般化を図り、安定的に軸索伸長を誘導し、蛍光免疫染色を用いて詳細に形態を観察するプロトコールを作成した。更に、軸索伸長の定量的評価方法についても検討し、画像解析により2値化を行うことで染色を用いずに神経突起を明瞭に描出し、定量する手法をまとめた。
一方で、グリア系細胞を伴ってRGC軸索伸長を誘導する手法を確立し、グリア系細胞の分化とRGCとのクロストークを明らかにする目的で、培養条件によるグリア系細胞の分化及び遊走の誘導を確認した。
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