| 研究課題/領域番号 |
16K20391
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
井上 岳人 兵庫医科大学, 医学部, 研究生(研究員) (30772652)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 精巣生殖細胞 / ライディッヒ細胞 / インターロイキン‐18 / アポトーシス / デスレセプター経路 / ミトコンドリア経路 / 急性炎症 / エンドトキシン |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は全身性の炎症状態における内因性IL-18が、精巣細胞のアポトーシスにおいて、どういったシグナル伝達経路を利用しているかを明らかにすることを目標として検討を行った。そこで、マウスを用いて（エンドトキシンによる）急性炎症期ならびに炎症後の回復期モデルを作製し、精巣生殖細胞のアポトーシスシグナル伝達経路であるデスレセプター経路ならびにミトコンドリア経路に関与する因子とIL-18との関係性について解析した。結果、急性炎症下の精巣において、内因性IL-18がデスレセプター経路関連因子の発現を促進し、caspase-8を介し、同時に、ミトコンドリア経路関連因子の発現を調整し、caspase-9を介し、生殖細胞のアポトーシスを誘導することが明らかとなった。一方、回復期の精巣では内因性IL-18がデスレセプター経路関連因子の発現を低下させ、caspase-8を介した生殖細胞のアポトーシスを抑制するものの、caspase-9依存的経路に対する影響は見られなかった。本研究結果から、IL-18が急性炎症期と炎症後の回復期における精巣生殖細胞のアポトーシスシグナル伝達経路関連因子の発現を調整する働きが明らかとなった。
次に、マウスライディッヒ細胞由来TM3細胞を用いてin vitroで炎症刺激（lipopolysaccaride: LPS）によるライディッヒ細胞のアポトーシス関連因子の発現を経時的に検証した。LPS刺激によりデスレセプター経路関連因子の発現が増加し、LPS刺激6時間でライディッヒ細胞のアポトーシスが確認でき、刺激12時間以降増加した。本研究により平成29年度予定していた「炎症刺激下でのライディッヒ細胞のIL-18の産生能やライディッヒ細胞へのIL-18の影響」を検証するための基盤となる結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成28年度予定していた、エンドトキシン血症下のマウス精巣生殖細胞のアポトーシスシグナル伝達経路とIL-18との関係性の検証はほぼ終了し、急性炎症下ならびに回復期において内因性IL-18が精巣生殖細胞のアポトーシスを調整する機序の一端を解明することができた。
また、平成29年度予定していた精巣関連培養細胞を用いた検討において、マウスライディッヒ細胞由来TM3細胞を用いてin vitroで炎症刺激（lipopolysaccaride: LPS）実験を開始することができた。LPS刺激下でのライディッヒ細胞のアポトーシスにデスレセプター関連因子が関与し、LPS刺激6時間でアポトーシスが確認でき、12時間以降発現が増加することが解明された。
故に、到達度としては、平成28年度予定していた急性炎症下での精巣生殖細胞のアポトーシスに対するIL-18の役割が解明できたこと、次年度予定していた炎症刺激下でのライディッヒ細胞のアポトーシスの検証が進行していることなどから、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜ライディッヒ細胞の炎症反応について＞平成28年度の検討では炎症刺激（lipopolysaccaride）下のライディッヒ細胞のアポトーシスにはデスレセプター経路が関与し、アポトーシスが誘導されることを示した。マウスライディッヒ細胞由来TM3細胞を用いて同経路にかかわる因子について更に解析を行う予定である。同時にライディッヒ細胞の重要な役割であるステロイドホルモン産生能ならびにIL-18産生能の解析を行う。炎症刺激下でのTM3細胞のIL-18の発現に変化があればsiRNA IL-18をTM3細胞に導入しTM3細胞由来IL-18のTM3細胞自身に対する役割を検証する予定である。
＜IL-18のライディッヒ細胞に対する働きについて＞急性炎症下の精巣ではIL-18の発現の増加が確認されている。TM3細胞をrecombinant IL-18で刺激し、ライディッヒ細胞に対するIL-18の働きを解析する。炎症刺激実験同様、アポトーシス経路関連因子ならびにステロイドホルモン産生能の解析を行う予定である。recombinant IL-18刺激に対するライディッヒ細胞の感受性が確認できた場合、マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞との共培養実験を行う予定である。
＜エンドトキシン血症モデルへのIL-18中和抗体投与実験＞IL-18中和抗体投与によりエンドトキシン血症モデルマウスの精巣生殖細胞のアポトーシスを抑制できるか検証する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該計画予定よりもIL-18KOマウスの繁殖が順調であり、匹数の確保が予定よりも容易であったこと、マウス実験でもっと細かく時間を刻んで検討する予定だったが、12時間と48時間のタイムポイントで目的とした結果が得られたため、予定のタイムポイントより絞って検討ができたことにより、全体的に試薬量が少なく抑えることができたこと、ならびにELISAや抗体を使用した実験では未解析な検体や項目が数点残っており、その分の試薬類をまだ購入していない為に次年度使用額が生じている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
残っているマウスの検体の発現解析や炎症刺激下ならびにrecombinant IL-18刺激でのライディッヒ細胞のアポトーシス関連因子の発現解析やステロイドホルモンの測定などに関連する抗体、ELISA kit、recombinant IL-18などの購入に使用する予定である。
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