| 研究課題/領域番号 |
16K20467
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
山田 理絵 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 非常勤講師 (70772151)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 歯髄 / コラーゲンゲル / 再生医療 / 移植 / 細胞培養 |
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| 研究実績の概要 |
外傷などにより過度な外力を受け脱臼した歯は、脱落後の経過時間が長く、歯根膜に障害が及んだ場合などで保存不可能な場合、壊死歯根膜組織を除去した後再植術が行われる。その場合、術後に外部吸収や骨性癒着が生じやすくなるため、その防止には歯根膜様組織の介在が必要となる。本研究の目的は、脱臼歯を歯髄由来細胞含有コラーゲンゲルで被包し、その後の治癒形態について病理組織学的に検討することである。
初年度ではヌードマウスへの移植実験に十分必要な細胞数が得られなかったため、再度初代培養を行った。すなわち、５週齢のWistar系雄性ラットを入手し、上顎および下顎の切歯計４本を抜去し、歯をメスで半切後、歯根中央1/3と根尖1/3の歯髄組織を摘出した。摘出した歯髄組織は細切し、タイプⅣコラーゲンコート100㎜ディッシュに静置し、5% CO2 37℃環境下で自家調整した10% FBS添加DMEM培養液を用いてout growth法で初代培養を行った。残った象牙質で2×2㎜の象牙質片を作製し４℃リン酸緩衝液中に保管した。当初予定していた根中央1/3から十分な細胞数が得られなかった為、根尖1/3から得た歯髄由来細胞を用いて実験を行った。
１×105個/mlに調整した歯髄由来細胞（４代継代）を3㎎/mlの濃度に調整されたコラーゲンゲルと混和し、作製した歯髄由来細胞含有コラーゲンゲルの内部に象牙質片を入れ、被包体を作製した。
つぎに５週齢の雄性ヌードマウスを入手し、全身麻酔を施した後背部皮膚に切開を加え、作製した被包体を筋膜上に置き、閉鎖した。６週間後、移植片および周囲の組織を一塊として摘出し４%パラホルムアルデヒドに浸漬固定した。10%EDTA溶液で脱灰後、通法に従いパラフィン包埋を行い、連続切片を作製後、HE染色およびDMP-1、nestinを用いた免疫染色を行い組織学的および免疫組織学的検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度の当初の予定はラットの歯髄から得た歯髄由来細胞を用いてラットの上顎第一臼歯（M1）に対し意図的再植術を施し、組織学的および免疫組織学的観察を行う予定であったが、前年度にラットの上下顎切歯４本を抜去し、歯髄組織を摘出後歯根中央1/3の歯髄組織を細切しout growth法で初代培養を行ったが、CO2インキュベーターの不調やコンタミネーションの発生など起こったため細胞の増殖が不十分になり、十分な細胞数が得られず、ヌードマウスへの移植実験を行うことが出来なかった。そのため本年度は再度初代培養を行い、実験に使用する細胞を確保することにした。細胞培養の初期は細胞の状態が安定せず、細胞が外生し増殖がみられても緩やかであったため実験に必要な数に達するまでに時間を要した。そのため、当初予定していたラットの意図的再植まで行うことが出来ず、ヌードマウスの背部皮下組織に歯髄由来細胞を移植するまでとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Wistar系雄性ラットの上顎第一臼歯（M1）に対し意図的再植術を行い、被験歯周囲の硬組織再生に関して病理組織学的に検討を行う予定である。すなわち、８週齢のWistar系雄性ラットに全身麻酔を施し、被験歯である上顎第一臼歯（M1）を抜去し、歯根の先端を切除、逆根管充填を施す。当初は逆根管充填材として光硬化性根管充填用シーラーを用いる予定だったが、炎症反応を起こす可能性ある材料を使用するのを避けるため、生体適合性に優れるMTAセメントを用いる予定である。被検根管は最も大型である近心根とし、歯根膜をスケーラーまたはメスで除去し、他の歯根は歯根膜を除去せずに通法の再植術を行う。その際、抜歯窩にコラーゲンゲルを併用するもの、併用しないものの２群に分ける。
実験期間は２週と４週とし、実験期間終了後にサクリファイスし、上顎骨を一塊として取り出し４%パラホルムアルデヒドに浸漬固定する。EDTA脱灰、トリミング後、通法に従いパラフィン包埋を行う。作製した連続パラフィン切片をHE染色、免疫染色等を行い、再植後の治癒経過を病理組織学的に評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はラット切歯を抜去し、out growth法で初代培養を再度行い、実験に用いるのに十分な細胞数を得るのに時間を要した。そのため歯髄由来細胞を含有させ、象牙質片を被包させたコラーゲンゲルをヌードマウスの背部皮下に移植し、組織学的および免疫組織学的に観察、検討するまでは達成したが、ラット上顎第一臼歯（M1）を被験歯とした意図的再植までは達成できなかった。そのため、今年度に購入する予定であったラットの意図的再植術に用いる器具や材料、ラットおよびそれに関する消耗品を次年度に購入する予定に変更したため、次年度使用額が生じた。
次年度はラットの意図的再植実験および必要に応じてヌードマウスへの移植実験の追加実験を行い、それに関する材料や消耗品の購入、および学会発表を行うための出張費、論文投稿費などに使用する予定である。
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