| 研究課題/領域番号 |
16K20547
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
梶山 創太郎 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (00760414)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヒト臍帯組織由来幹細胞 / ヒト骨髄細胞培養上清 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト臍帯組織由来幹細胞は医療廃棄物である臍帯より採取するためドナーに新たな侵襲を加えることなく十分な細胞を確保でき、また免疫寛容性を有するため、他家移植への臨床応用細胞ソースとして期待されている。本研究では臨床応用を見据えて無血清培地を用いてヒト臍帯組織由来幹細胞を分化・誘導後、ラットに移植し、骨形成を確認することで、新たな幹細胞ソースの生体移植細胞としての有用性について探り、新規の骨再生療法を開発することを目的とする。
平成２８年度の研究では、無血清培地を用いてヒト臍帯組織由来幹細胞を分化・誘導することを目的として研究を行った。ヒト臍帯組織間葉系幹細胞をより効果的に骨系へと分化させるために、最適なヒト骨髄細胞培養上清採取期間について検討した。ヒト骨髄細胞培養上清を増殖期、コンフルエント期、石灰化期の３つの期間にわけてヒト臍帯組織間葉系幹細胞に添加した。また、ヒト臍帯組織間葉系幹細胞は血清の有無によって細胞採取・培養したものの２種類を使用した。タイムポイントは２・３・４週としてALP染色、ALP assay、Alizarin Red染色、遺伝子発現を評価方法とした。
ヒト骨髄細胞培養上清の３つの期間の検討では、コンフルエント期と石灰化期は増殖期よりもALP染色、Alizarin Red染色での陽性染色反応が明らかだった。また、無血清培地下で細胞採取・培養したヒト臍帯組織間葉系幹細胞は血清を用いて培養したときよりもALP染色、Alizarin Red染色での陽性染色反応が認められた。
コンフルエント期、石灰化期のヒト骨髄細胞培養上清を用いることにより、ヒト臍帯組織間葉系幹細胞をより効果的に石灰化誘導されることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２８年度の研究において、ヒト臍帯組織間葉系幹細胞をより効果的に骨系へと分化させるために、最適なヒト骨髄細胞培養上清採取期間についてin vitroにて検討した結果、３つの期間ではコンフルエント期と石灰化期の培養上清は増殖期の培養上清よりもヒト臍帯組織間葉系幹細胞をより効果的に石灰化誘導させることが示唆された。これは当初立てた仮説通りの結果であった。また、無血清培地下で細胞採取・培養したヒト臍帯組織間葉系幹細胞は血清を用いて培養したときよりもALP染色、Alizarin Red染色での陽性染色反応が認められた。これについては予期していた結果とは異なるため、なぜそのような結果が得られたのかについて考察中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策として、in vitroにおいて上記のような結果が出たことに対して、核実験群よりRNAを抽出し、RT-PCRを行い、遺伝子発現について確認していく予定である。RT-PCRはCol I、Runx2、ALP、Osterix、Osteocalcin、BSPの硬組織関連遺伝子発現を確認する。これによりヒト臍帯組織間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導時の遺伝子発現を確認する。
また、無血清培地で分化誘導したヒト臍帯組織間葉系幹細胞を免疫不全ラットに移植し、骨形成の検討を行う。評価方法についてはμＣＴによる骨形成量の観察、Ｈ・Ｅ染色による組織学的観察を行う予定である。
また、研究が当初の計画通りに進まないとき、HUCPVCsには、未分化間葉系のマーカーであるSSEA-3を有する細胞が含まれていることが知られていることから、フローサイトメトリーを用いてセレクションして培養し、分化誘導させて移植することを考えている。
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