| 研究課題/領域番号 |
16K20598
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
大野 幸 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 助教 (00535693)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 三叉神経脊髄路核尾側亜核 / 痛覚神経回路 / 下降抑制系 / 単一ニューロン標識法 |
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| 研究実績の概要 |
「痛み」は生体内外からの警告のサインであり、傷害を受けた生体に安静を促し創傷治癒を早めるためにも必要な感覚である。しかし、目的を達した後にも残存する「痛み」は、正常な活動を制限し生存にとって不利にも働く諸刃の剣であるため、生体には痛みを伝える機能だけではなく、抑える機能も備わっている。痛みの神経回路が他の感覚回路と比べてユニークな点は、痛みの伝達と抑制という真逆の機能が１つの感覚を生み出す回路に含まれているところにある。本研究では、伝達系と抑制系の相互媒介の要となる回路に的を絞り、回路の最小単位である単一ニューロンレベルにまで分解して詳細な解析を行い、ボトムアップ的に痛みのメカニズムを解明することを目的としている。
そこで、まず口腔・顔面領域の痛みが中枢神経へ伝えられる入り口にあたる三叉神経脊髄路核尾側亜核（Sp5C）に着目した。その理由として1) Sp5Cのニューロンは痛みの伝達だけではなく、痛み抑制のシグナルも受けること2)Sp5Cには痛みを伝える2次ニューロンの他に、 痛みの調節に関与すると考えられる多種類の介在ニューロンが存在することがあげられる。1), 2)よりSp5Cは痛みの伝達と抑制という真逆の情報を受け取っているが、Sp5Cのどの種類のニューロンがどの情報を受け取っているのかが明らかにされていない。そこでまずは①Sp5Cニューロンの化学的マーカーによる体系的な分類を行い②その後単一Sp5Cニューロンの形態学的な解析を行うこととした。
しかし、実験の作業効率と今後の発展（遺伝子組換え動物の導入）を考え、実験動物をラットからマウスに切り替え、マウスでの実験手技の習得および条件検討を行った。その間に、痛みの感じ方には日内変動があるとする先行研究が発表されたことから、本研究においてもマウスの生体リズムを把握した上で実験を遂行するよう時間生物学的手法を取り入れた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
痛みの感じ方には日内変動があるとする先行研究が発表されたことから、今回目的とする疼痛関連のターゲットタンパクの発現量にも日内変動があると予想される。そこで本研究を遂行するにあたり、まずはマウスの生体リズムを把握する必要があると考え時間生物学的手法を取り入れ、本研究の関連実験及び予備実験として位置づけその成果を学会で報告した。
１）関連実験：夜行性のマウスは活動期の夜間に１日活動量の90％以上活動し、１日摂食量の85%以上を摂食する規則正しいパターンを示すが、例えばマウスが活動期の暗期に光暴露されると、それだけで体内時計は狂い、いわゆる時差ボケの状態となる。時差ボケマウスでは、規則正しい日内変動を示していた生理機能も乱れるため、今回ターゲットとしているニューロペプチド（ソマトスタチン、エンケファリン、サブスタンスPなど）や受容体（μオピオイド受容体、α１,α２受容体、5-HT1,5HT3受容体など）あるいはその他の蛋白（パルアルブミン、nNOS、カルビンディンなど）といったタンパクの発現量にもばらつきが生じ、適切なデータが得られない可能性が生じることが明らかとなった。
２）予備実験-時計遺伝子 (per2) 発現の日内変動の解析：時計遺伝子の１つであるPer2遺伝子の発現を、発光強度に置き換えて評価する方法があるが、今回は、下行抑制系に関与する、脳幹大縫線核、青斑核、中心灰白質、三叉神経脊髄路核においてPer2遺伝子の発現を解析したところ、日内リズムは観察されなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
時間生物学的手法に基づいたマウスの飼育方法や、実験手技を習得したため、今年度からはマウスを用いて、当初の目的であった三叉神経脊髄路核での解析を進めていく方針である。また、遺伝子組換えマウスを導入し、痛覚の日内変動に関連すると考えられるタンパクを三叉神経領域で引き続き検索する予定である。
①単一Sp5Cニューロンへのウイルスベクター注入と、これを可視化する条件の最適化
1)１０週齢マウス（C57BL/6）を麻酔下で定位脳手術装置に固定し、ガラス電極経由でSindbisウイルス液を空気圧式微量注入器にてSp5Cに注入する。2)マウスを灌流固定後、脳を摘出し、連続凍結切片を作製。3)免疫組織化学法を用いて、Sp5Cニューロンを可視化。この過程で、ガラス電極の注入座標、その座標への解剖学的アプローチ方法、ガラス電極先端の形状、ウイルス液の濃度、ウイルス注入から灌流固定までのSurvival Timeの長さ、最適な薄切断面、抗体の濃度や染色時間の検討を行う。
② 可視化された単一Sp5Cニューロンの３次元的な再構築と形態学的解析
作成された標本を、デジタル標本作製システムを用いて網羅的に撮影して完全にトレースし、樹状突起および軸索を再構築する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、実験動物をラットからマウスに変更したため、マウスを用いた実験のための環境整備を重点的に行った。そのためそれに伴う出費は発生したが、実験に必要な大型の機材や物品は次年度に順次購入予定としている。また、当初予定していた実験系に加え、マウスの生体リズム測定系も追加でセットアップする方針とし、そちらにも予算配分をしたことにより次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
追加実験で遺伝子組換えマウスを導入予定だが、このマウスの購入及び維持管理費用の他、遺伝型判定のための測定機器一式、免疫組織化学染色法によるタンパク同定および定量関連試薬、一般試薬、外科用処置セットなどを購入予定である。これらに加え、共同研究先との研究打ち合わせ、関連学会、勉強会などへの参加にも使用する予定である。
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