| 研究課題/領域番号 |
16K20598
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
大野 幸 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, その他 (00535693)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 三叉神経系 / 痛覚神経回路 / 下降抑制系 / 時間生物学 |
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| 研究実績の概要 |
「痛み」は生体内外からの警告のサインであり、傷害を受けた生体に安静を促し創傷治癒を早めるためにも必要な感覚である。しかし、目的を達した後にも残存する「痛み」は、正常な活動を制限し生存にとって不利にも働く諸刃の剣であるため、生体には痛みを伝える機能だけではなく、抑える機能も備わっている。痛みの神経回路が他の感覚回路と比べてユニークな点は、痛みの伝達と抑制という真逆の機能が１つの感覚を生み出す回路に含まれているところにある。本研究では、伝達系と抑制系の相互媒介の要となる回路に的を絞り、回路の最小単位である単一ニューロンレベルにまで分解して詳細な解析を行い、ボトムアップ的に痛みのメカニズムを解明することを目的としている。
まず、実験の作業効率と今後の発展（遺伝子組換え動物の導入）を考え、実験動物を当初予定していたラットからマウスに切り替え、マウスでの実験手技の習得および条件検討を行った。また、痛みの感じ方には日内変動があるとする先行研究が発表されたことから、痛みの伝達系と抑制系それぞれにも、１日の中でリズムがあるのではないかと考え、本研究においてもマウスの生体リズムを把握した上で実験を遂行するよう時間生物学的手法を取り入れた。そこで本年度は、三叉神経系の入り口にあたる三叉神経節における時計遺伝子発現の日内変動を検討し、三叉神経系における痛覚との関連を検討した。その結果マウスの三叉神経節において、時計遺伝子Period2の作り出す時計蛋白PER2の発現には明瞭な日内変動が観察された。さらに、このPER2は痛覚の伝達に関与するとされるCGRPと共存することも明らかとなった。このことから、三叉神経系における痛覚の日内変動とも何らかの関係を有することが予想される。今後は、痛覚の抑制系に関与するマーカーとの共存を検討して行く予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
痛みの感じ方には日内変動があるとする先行研究が発表されたことから、目的とする三叉神経系における疼痛伝達あるいは抑制に関連するタンパクの発現量にも日内変動が予想される。本研究を遂行するにあたり、まずはマウスの生体リズムを把握する必要が必須であると考え、当初の研究計画に時間生物学的手法を取り入れその成果1)2)を学会等で報告した。
１）三叉神経節における時計遺伝子の発現について：時計遺伝子の１つであるPer2遺伝子の発現を、発光強度にて評価する方法がある。今回はこの手法を用い、三叉神経節における時計遺伝子発現の日内変動を検討し、三叉神経系における痛覚との関連を検討した。その結果マウスの視交叉上核および三叉神経節のどちらにおいても、時計蛋白PER2の発現には明瞭な日内変動が観察された。三叉神経節で観察されたリズムは暗期の中頃にピークを持ち、このピークは１日目で最も高い値を示した後、徐々に減衰した。また、免疫組織化学法により、このPER2を発現しているニューロンは痛覚の伝達に関与するとされるCGRPと共存することも明らかとなった。
２）急性持続性疼痛の動物モデルを用いた、三叉神経支配領域における痛みの日内変動の解析：マウスの右側上口唇（三叉神経第二枝領域）にホルマリン（5％、10μl）を皮下注射した後、45分間ビデオ撮影し、疼痛関連行動の行動回数や持続時間を評価した。また、そのマウスを灌流固定し、脳を取り出した後、凍結スライス切片を作成し、免疫組織化学染色によりターゲットタンパク（c-Fos）の発現動態を観察した。その結果、マウスの休息期にあたる明期において、biting、guardingなど疼痛関連行動が認められ、三叉神経脊髄路核尾側亜核において疼痛関連タンパクのc-Fosの発現が観察された。
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| 今後の研究の推進方策 |
時間生物学的手法に基づいたマウスの飼育方法や、実験手技を習得後、予備実験や関連実験は終了した。今年度からは引き続き当初の目的であった三叉神経系での解析を進めていく方針である。
1)三叉神経節における時計遺伝子の発現について：三叉神経脊髄路核尾側亜核（Sp5C）へ逆行性トレーサーを注入し、三叉神経節で逆行性標識されたニューロンと時計タンパクPER2発現の共存関係および日内変動を検討する。
①マウスを定位脳固定装置に固定し、Sp5Cへ逆行性トレーサー（CTB）を注入する。その際、注入部位の座標や注入濃度、注入量などの条件検討を行う。②三叉神経節において逆行性に標識されたニューロンを痛みに関係するニューロンとして同定し、蛍光免疫染色により可視化する。③②のニューロンとPER2の蛍光二重染色により共存関係を確認し、日内変動を検討する。
2)急性持続性疼痛の動物モデルを用いた、三叉神経支配領域における痛みの日内変動の解析：昨年度は、休息期（明期）におけるデータ採取を行ったため、今期は活動期（暗期）におけるデータ採取方法を確立し、休息期（明期）と活動期（暗期）における疼痛関連行動やc-Fos発現の違いを比較検討する。
3)以上の結果をまとめ、学会報告及び論文発表を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、前年度からの繰越金額が多かったため、大型の実験機材などを購入してもなお、繰越し分の差額が生じた。次年度は、研究継続に必要な経費（実験試薬、動物維持管理費）に加え、学会旅費や論文掲載代などに使用する計画である。
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