|
1年目では実験的に製作した萎縮顎下腺を検体とし、その細胞懸濁液からスフェロイド培養を実施することを目的とした。Wistar系ratを用いGA/LA下に両側顎下腺主導管を顎下部切開にて剖出し、Ti-clipで結紮し閉創。以後、7日間の主導管結紮持続状態で飼育し、術後7日で両側顎下腺を摘出。このプロトコルにより採取した検体について半割を行い、その一方について凍結切片を製作し、萎縮の程度を確認した。萎縮が確認できた顎下腺から細胞懸濁液を製作し種々の細胞数に調整後、96穴U底プレートに播種した。その結果、細胞の集合塊が形成され、HE/PAS染色で形態を観察したところU底に接している部位で被膜様に細胞が並んでいた。
2年目ではスフェロイド培養について、1年目で検討できなかった各種顎下腺構造の行方について検討をすることを目的とした。細胞塊に対しalpha-SMA、CK-18について免疫染色を行った。細胞塊の中央部にalpha-SMAの陽性細胞が観察されたが、CK-18は反応陰性であった。未分化な細胞集団の存在を確認する目的でSca-1、C-kitについて免疫染色を行ったところ、細胞塊周囲で一部に陽性反応を認めた。また、新たなる免疫染色のtargetを探索するため、従来から用いている動物実験モデルに則り、transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)についてその局在と萎縮唾液腺再生過程との相関を検討した。TGF-beta1は再生過程で観察されるduct like structure(DLS)の外周にalpha-SMA陽性を呈する筋上皮細胞の局在と一致して認めらた。DLSは未分化な細胞集団が内在されており、TGF-beta1は唾液腺再生に寄与していることが示唆された。スフェロイド培養についてTGF-beta1の関与を今後検討する必要があると考えられた。
|
